Elaborazione dei tessuti infetti per l'enumerazione batterica in un modello di co-infezione del muro

Abstract

Fonte: Lenhard, A., et al. Un modello murino per la transizione di Streptococcus pneumoniae da colonizzatore a patogeno dopo la co-infezione virale riproduce la malattia aggravata dall'età. J. Vis. Esp. (2022)

Questo video mostra l'elaborazione dei polmoni da un topo co-infettato da un batterio patogeno e un virus. La trituratura, omogeneizzazione e placcatura del tessuto polmonare permettono di quantificare il carico batterico, indicando la diffusione batterica ai polmoni e la gravità della malattia.

Protocollo

Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato locale istituzionale per la cura degli animali e dal comitato veterinario JoVE.

1. Trattamento dei tessuti infetti per l'enumerazione batterica

1. Collezione polmonare
   1. Usando forbici disezionali, taglia i lati della gabbia toracica esposta e tira delicatamente le costole verso la testa del topo per esporre il cuore. Inserire un ago da 25 G collegato a una siringa da 10 mL pre-riempita con soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) nel ventricolo destro e iniziare a perfusere lentamente. Cerca lo sbiancamento dei polmoni come indicatore di una perfusione di successo. Sciacquica lentamente per evitare di rompere il tessuto polmonare.
   2. Solleva il cuore con la pinza e fai un taglio per separare polmoni e cuore. Una volta separati, raccogli tutti i lobi del polmone con la pinza e risciacqua in una ciotola con PBS sterile per rimuovere eventuali residui di sangue. In una piastra di Petri, trita i polmoni in piccoli pezzi e mescola bene. Rimuovere metà della miscela polmonare per determinare le unità batteriche formanti la colonia (CFU) o le unità formanti placca virale (PFU) e inserirla in un tubo con fondo rotondo da 15 mL pre-riempito con 0,5 mL di PBS per l'omogeneizzazione.
      NOTA: È importante non prendere lobi diversi dello stesso polmone per le varie valutazioni. Invece, tutti i lobi dovrebbero essere tritati, ben mescolati insieme e distribuiti in modo uniforme per le diverse valutazioni.
2. Per omogeneizzare il tessuto raccolto, si pulisce prima la sonda omogeneizzatrice mettendola al 70% di etanolo e accendendo l'omogeneizzatore al 60% di potenza per 30 secondi. Ripeti il passaggio in acqua sterile per 10 secondi. Omogeneizza ogni tessuto per 1 minuto. Pulire la sonda omogeneizzatrice in acqua sterile tra ogni campione e in un tubo fresco al 70% di etanolo tra ogni organo e gruppo campione.
3. Enumerazione dei numeri batterici
   1. Una volta che tutti gli organi sono stati prelevati e omogeneizzati, si verificano diluizioni seriali sulle placche di agar di sangue. Per calcolare la CFU totale, si usano 10 μL per placcare e annotare il volume finale in mL per ogni campione. Incubare durante la notte a 37 °C/5% di_CO2.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Siringhe usa e getta BD con punte Luer-Lok (1 mL)	Fisher	14-823-30
Forbici delicate da sezionare Fisherbrand	Fisher	08-951-5	Strumenti utilizzati per la raccolta
Fisherbrand che disseziona le pinze tissutali	Fisher	13-812-38	Pinze per il raccolto
Siringhe Fisherbrand sterili per uso singolo (10 mL)	Fisher	14-955-459