Generazione di un monostrato colonoide umano con funzione barriera per studiare le interazioni ospite–patogeno

Abstract

Fonte: In, J. G., et al. Monostrati colonoidi umani per studiare le interazioni tra patogeni, commensali ed epitelio intestinale ospite. J. Vis. Esp. (2019).

Questo video mostra la procedura per la coltivazione di cellule epiteliali derivate dal colon su un sistema Transwell rivestito di collagene per generare uno strato monostrato che produce muco e modella la barriera intestinale e consente studi di interazione ospite–patogeno.

Protocollo

1. Corazzatura della sospensione enteroide/colonoide

1. Se gli inserti rivestiti sono stati conservati a 4 °C, si equilibrano in un incubatore di colture tissutali al 37 °C/5% CO₂ per almeno 30 minuti prima della placcatura cellulare.
2. Per ogni inserto da placcare, si prepara 1 mL di mezzo di espansione caldo (tra 25 e 37 °C) e si aggiungono 10 μM Y-27632 e 10 μM CHIR 99021.
   NOTA: L'EM è composto da DMEM avanzato (Dulbecco's Modified Eagle Medium) /F12 contenente B27 (1x), mezzo condizionato al 50% WNT3A, 15% mezzo condizionato RSPO1, mezzo condizionato a Noggin al 10%, 50 ng/mL EGF umano (fattore di crescita epidermica), 500 nM A-83-01, 10 μM SB 202190, cocktail antibiotico/antimicotico (1x), 10 mM HEPES (N-(2-Idrossietil)piperazina-N'-(2-acido etanosulfonico)), L-alanil-L-glutamina dipeptide (1x) e penicillina-estreptomicina (1x) (vedi Tabella dei Materiali).
3. Aspirare il mezzo di lavaggio dal tubo contenente il pellet cellulare e risospendere in un volume di EM sufficiente a ottenere almeno 100 μL/inserto.
4. Aspirare la soluzione endovenosa di collagene da ogni inserto e lavare due volte con 150 μL del mezzo per inserto.
5. Pipetta 600 μL di EM nello spazio sotto ogni inserto.
6. Pipetta 100 μL di sospensione cellulare in ciascun inserto.
7. Riportare la piastra nell'incubatore di coltura e lasciarla indisturbata per almeno 12 ore.
   NOTA: Evitare di scuotere o inclinare bruscamente la piastra per evitare una distribuzione disomogenea dei frammenti di colonnoide sulla membrana inserita.
8. Monitorare l'attacco cellulare e la diffusione per formare un monostrato confluente posizionando la piastra su un microscopio a contrasto di fase sotto una lente obiettivo 2,5x-10x.
9. Dopo 1-2 giorni, la maggior parte dei frammenti dovrebbe aderire alla matrice di collagene. Rinfresca il mezzo di coltura e interrompi il trattamento con Y-27632 e CHIR 99021. Continua a rinfrescare il substrato ogni 2-3 giorni fino a quando non diventa confluente. La confluenza si raggiunge generalmente in 7-10 giorni.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
2-Ammino-2-(idrossimetil)-1,3-propanediolo	Sigma	T4661	Base tris, componente del buffer di lisi
A-83-01	Tocris	2939	Inibitore ALK4/5/7
Acido acetico, glaciale	Fisher Scientific	A38
DMEM/F12 avanzato	Life Technologies	12634-010	Componente del mezzo di crescita
Cocktail antibiotico/antimicotico	Invivogen	ANT-PM-2	Primocin (100 volte)
B27, 50x	Life Technologies	17504-044	Componente del mezzo di crescita
Inserti di coltura cellulare	Corning	3470	Transwell, membrana PET, poro 0,4 μm, piastra a 24 pozzi
CHIR 99021	Tocris	4423	Inibitore GSK3β
Collagene IV, dalla placenta umana	Sigma	C5533
Soluzione per il Raccolto Organoidi Cultrex	Trevigen	3700-100-01	Depolimerizza la matrice della membrana basale
Etanolo, assoluto	Pharmco	111000200
GlutaMAX	Life Technologies	35050-061	Dipeptide L-alanyl-L-glutamina, 200 mM
HEK293T/Linea cellulare Noggin-Fc	van den Brink Lab, Istituto Tytgat per la Ricerca sul Fegato e l'Intestino		Per la produzione di mezzo condizionato a Noggin
HEK293T/RSPO1-Fc-HA	Trevigen	3710-001-K	Per la produzione di mezzo condizionato Rspondin-1
HEPES, 1 M	Life Technologies	15630-080	Componente del mezzo di crescita
Fattore di crescita epidermica umana (EGF)	Sistemi di R&D	236-EG-01M	Componente del mezzo di crescita
Microscopio luminoso per coltura cellulare invertita	Olympus	CKX51
Linea cellulare L-WNT3A	ATCC	CRL-2647	Per la produzione di mezzo condizionato Wnt3a
Matrigel, fattore di crescita ridotto	Corning	356231	Matrice a membrana basale per coltura 3D
Raschietto a mini celle	United BioSystems	MCS-200
Anticorpo MUC2, monoclonale topo	Abcam	ab11197	Uso a 1:100 per l'immunocolorazione, 1:500 per l'immunoblotting
Particelle lentivirali di shRNA MUC2	GE Dharmacon	RHS4531	SHRNA lentivirale GIPZ, ID: 4583
Oscillatore orbitale	Strumenti di sovvenzione	Alimentatore 10i
Penicillina-estreptomicina, 100x	Life Technologies	15140-122	Componente del mezzo di crescita
Sondatore a sonda con microtip	Branson Ultrasonics	450
Cocktail inibitore della proteasi per cellule di mammiferi	Sigma	P8340	Componente del buffer di lisi
SB 202190	Tocris	1264	Inibitore p38 MAPK
Cloruro di sodio	Sigma	S3014	Componente del buffer di lisi
Dexoicolato di sodio	Sigma	D6750	Componente del buffer di lisi
Dodecilsolfato di sodio	Sigma	L3771	Componente del buffer di lisi
TrypLE Express, 1x	Life Technologies	12605-010	Tripsina, per digerire frammenti di enteoide/colonoide
Anticorpo Vinculina, monoclonale del coniglio	Abcam	ab129002	Uso a 1:1000 per l'immunoblotting
Acqua, di grado coltura tissutale, sterile filtrata	Corning	25-055
Y-27632	Tocris	1254	Inibitore RhoA/ROCK