Generazione di sferoplasti da batteri gram-negativi

Abstract

Fonte: Figueroa, D. et al. Produzione e visualizzazione di sferoplasti e protoplasti batterici per caratterizzare la localizzazione dei peptidi antimicrobici. J. Vis. Esp. (2018).

Questo video mostra la preparazione degli sferoplasti da batteri gram-negativi a forma di bastoncello. I batteri si sviluppano in presenza di un antibiotico per formare filamenti allungati. Questi vengono lavati con una soluzione ipertonica e trattati con un tampone di lisi per rimuovere la parete cellulare esterna. Il trattamento ipotonico forma sferoplasti, che vengono stabilizzati con una soluzione isotonica raffreddata e conservati in condizioni fredde.

Protocollo

1. Preparazione della soluzione

NOTA: Preparare le soluzioni descritte nei passaggi 1.1–1.9 per produrre sferoplasti di Escherichia coli (E. coli )

1. Prepara 1 M di tris(idrossimetil)amaminometano cloruro (Tris-Cl), pH 7,8 sciogliendo 10,34 g di Tris·HCl e 4,17 g di tris(idrossimetil)amminatomano (Tris·OH) in 50 mL di acqua distillata (dH₂O) in una fiaschetta da 125 mL. Sterilizza filtrando attraverso un filtro a siringa da 25 mm con una membrana da 0,2 μm e conserva in un tubo conico a temperatura ambiente.
2. Prepara la soluzione A (20 mM cloruro di magnesio (MgCl₂), 0,7 M saccarosio, 10 mM Tris-Cl, pH 7,8) dissolvendo 0,10 g di MgCl₂ (95,2 g/mol) e 11,98 g di saccarosio (342,3 g/mol) in 25 mL dH₂O in una fiaschetta da 125 mL. Aggiungi 500 μL 1 M Tris-Cl (pH 7,8) e regola il volume a 50 mL. Sterilizza filtrando attraverso un filtro a siringa da 25 mm con una membrana da 0,2 μm e conserva in un tubo conico a temperatura ambiente.
3. Prepara la soluzione B (10 mM MgCl₂, 0,8 M saccarosio, 10 mM Tris-Cl, pH 7,8) sciogliendo 0,05 g di MgCl₂ (95,2 g/mol) e 13,69 g di saccarosio (342,3 g/mol) in 25 mL dH₂O in una fiaschetta da 125 mL. Aggiungi 500 μL 1 M Tris-Cl (pH 7,8) e regola il volume a 50 mL. Sterilizza filtrando attraverso un filtro a siringa da 25 mm con una membrana da 0,2 μm e conserva in un tubo conico a temperatura ambiente.
4. Preparare 0,8 M di saccarosio sciogliendo 13,69 g di saccarosio (342,3 g/mol) in 50 mL dH₂O in una fiaschetta da 125 mL. Sterilizza filtrando attraverso un filtro a siringa da 25 mm con una membrana da 0,2 μm e conserva in un tubo conico a temperatura ambiente.
5. Prepara 5 mg/mL di desossiribonucleasi I (DNasi I) dissolvendo 0,015 g di DNasi I in 3 mL di dH₂O in una fiaschetta da 50 mL. Sterilizza filtrando attraverso un filtro a siringa da 25 mm con una membrana da 0,2 μm. Soluzione aliquota in tubi microfuge e conserva a −20 °C.
6. Preparare 0,125 M di acido etilenediaminetetraacetico (EDTA), pH 8,0, dissolvendo 0,698 g di EDTA disodio diidrato (372,2 g/mol) in 15 mL dH₂O in una fiaschetta da 125 mL. Sterilizza filtrando attraverso un filtro a siringa da 25 mm con una membrana da 0,2 μm e conserva in un tubo conico a temperatura ambiente.
7. Preparare 600 μg/mL di cefalexina dissolvendo 0,03 g di cefalexina idrato (365,404 g/mol) in 50 mL di dH₂O in una fiaschetta da 125 mL. Sterilizza filtrando attraverso un filtro a siringa da 25 mm con membrana da 0,2 μm e conserva in un tubo conico a 4 °C.
8. Prepara 5 mg/mL di lisozima dissolvendo 0,015 g di lisozima in 3 mL di dH₂O in una fiaschetta da 50 mL. Sterilizza filtrando attraverso un filtro a siringa da 25 mm con una membrana da 0,2 μm. Soluzione aliquota in tubi microfuge e conserva a −20 °C.
9. Prepara 3% w/v di Tripticase Soy Broth (TSB) dissolvendo 30 g di TSB in 1 L di dH₂O in una fiaschetta da 2 L. Aliquota la soluzione in fiaschette contenenti 25 mL o 100 mL di TSB da utilizzare nella preparazione di sferoplasti di E. coli o protoplasti di B. megaterium, rispettivamente. Fiaschette autoclave per sterilizzare il mezzo liquido. Il TSB sterile può essere conservato sia a temperatura ambiente che a 4 °C.
10. Prepara la soluzione C (1 M saccarosio, 0,04 M maleato, 0,04 M MgCl₂, pH 6,5) sciogliendo 34,23 g di saccarosio (342,3 g/mol), 0,46 g di acido maleico (116,07 g/mol) e 0,38 g di MgCl₂ (95,21 g/mol) in 100 mL di dH₂O in una fiaschetta da 250 mL. Regola il pH a 6,5. Sterilizza filtrando attraverso un filtro a siringa da 25 mm con una membrana da 0,2 μm e conserva in un tubo conico a temperatura ambiente.

2. Preparazione della cultura notturna

NOTA: Eseguire le sezioni 2-3 utilizzando tecniche sterili appropriate. Se desiderato, un ceppo batterico può contenere un plasmide per la resistenza agli antibiotici per ridurre la potenziale contaminazione. Se si utilizza un ceppo con resistenza agli antibiotici, aggiungere gli antibiotici necessari nei passaggi 2.1 e 3.1–3.2.

1. Prepara una coltura notturna prelevando una singola colonia di batteri usando una punta sterile di pipetta e posizionandola in un tubo di coltura da 14 mL contenente 2–3 mL di 3% w/v TSB. Incubare a 37 °C, scuotendo per 16–21 ore.

3. Preparazione degli sferoplasti E. coli Gram-negativi

1. In una fiaschetta da 250 mL, diluire la coltura notturna 1:100 in un volume di 25 mL di 3% w/v TSB e incubare la soluzione batterica a 37 °C, scuotendo per circa 2,5 ore finché la soluzione non raggiunge una densità ottica di 0,5–0,8 a 600 nm. Misura la densità ottica usando uno spettrofotometro.
2. In una fiaschetta da 250 mL, diluire questa coltura 1:10 in 30 mL di 3% p/v TSB e incubare a 37 °C, scuotendo per 2,5 ore in presenza di 60 μg/mL di cefalexina (347,4 g/mol) per produrre filamenti monocellulari di circa 50–150 μm di lunghezza, osservabili sotto ingrandimento di 1.000X usando un microscopio luminoso (Figura 1B).
3. Ritira i filamenti centrifugando la soluzione batterica a 1.500 x g, 4 °C per 4 minuti. Scartare e scartare il soprannatante, riservando la pallina.
4. Lava i filamenti aggiungendo delicatamente 1 mL di saccarosio da 0,8 M, facendo attenzione a non disturbare il pellet. Incuba per 1 minuto, poi scarta il soprantantante senza disturbare il pellet.
5. Aggiungere 150 μL di 1 M Tris-Cl (pH 7,8), 120 μL di 5 mg/mL di lisozima, 30 μL di 5 mg/mL di DNasi I e 120 μL di 0,125 M EDTA nel rispettivo ordine e incubare la soluzione a temperatura ambiente per 10 minuti.
6. Aggiungi gradualmente 1 mL di soluzione A per 1 minuto alla soluzione preparata in 3,5 con una micropipetta, facendo ruotare delicatamente la soluzione a mano. Incuba la soluzione per 4 minuti a temperatura ambiente.
7. Inserire 7 mL di soluzione B a 4 °C in due tubi conici da 15 mL. Aggiungi quantità uguali della soluzione preparata in 3,6 a ciascuno di questi due tube. Centrifugare la soluzione a 1.500 x g, 4 °C per 4 minuti.
8. Utilizzando una pipetta sierologica, rimuovere con cura tutto tranne 1-2 mL di sovrantantante senza disturbare il pellet. Risospendi il pellet pipettando delicatamente su e giù usando una micropipetta P1000. Verifica visivamente la formazione degli sferoplasti osservando il campione a un ingrandimento di 1.000 volte con un microscopio lucico (Figura 1C).
9. Conserva gli sferoplasti a -20 °C per fino a una settimana o fino a quando non hanno attraversato 3 cicli di congelamento-disgelo.

Risultati

Figura 1: Immagini rappresentative di Escherichia coli. (A) batteri E. coli , (B) serpente E. coli e (C) E. coli sferoplasto. Le immagini sono state scattate con un ingrandimento...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Trizma cloridrato (Tris HCl)	Sigma	T3253
Trizma base (Tris OH)	Sigma	T1503
Cloruro di magnesio	Sigma	M8266
Sucrosio	Sigma	S7903
Lisozima	Sigma	L6876
Desossiribonucleasi I	Sigma	D4527
Acido etilendediaminatetraacetico	Sigma	106361	Ha utilizzato Sigma 106361 nello sviluppo originale del protocollo; 106361 interrotto con ED2SS come sostituto
Idrato di cefalexina	Sigma	C4895
Brodo di soia BBL Trypticase	Fisher Scientific	B11768
Acido maleico	Sigma	M0375
Filtro a siringa Acrodisc 25 mm con membrana HT Tuffryn da 0,2 μm	Pall Corporation	4192