Stabilimento di un modello murino di infezione vaginale da Streptococcus di gruppo B

Abstract

Fonte: Patras, K. A., Doran, K. S. Un modello murino di colonizzazione vaginale di Streptococcus di gruppo B. J. Vis. Esp. (2016)

Questo video mostra la preparazione e l'inoculazione vaginale di una femmina di topo trattata con ormone e Streptococcus del gruppo B per modellare l'infezione. Spiega come coltivare e preparare i batteri, somministrare l'inoculo nel lumen vaginale e garantire un'infezione di successo.

Protocollo

Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato locale istituzionale per la cura degli animali e dal comitato veterinario JoVE.

1. Inoculazione vaginale con Streptococco di gruppo B (GBS)

1. Un giorno prima dell'inoculazione, si coltiva una coltura liquida notturna da 5 ml di un ceppo di GBS di interesse, come A909 (sierotipo Ia), nel brodo Todd Hewitt (THB) a 37 °C.
2. Subcoltura il GBS durante la notte a un volume 1:10 in THB fresco e incuba a 37 °C. Fai crescere i batteri fino alla fase media logaritmica (OD₆₀₀ = 0,4-0,5).

NOTA: Questo richiede tipicamente 2-3 ore, a seconda della tensione di GBS.

3. Trasferire la sottocoltura in un tubo conico sterile da 15 ml e pelletare i batteri a 3.000 × g per 5 minuti. Aspira il soprandante. Risospendere il pellet batterico in 200 μl di soluzione salina sterile tamponata con fosfato (PBS).
4. Utilizzando il pellet sospeso, porta 3 - 5 ml di PBS (1 ml ogni 10 topi) a esattamente diametro_{diametrale 600} = 0,4 in un nuovo tubo di coltura da 5 ml. Questa sarà una concentrazione di ~ 1 × 10⁸ unità formative di colonie (CFU)/ml. Trasferisci in un nuovo tubo conico da 15 ml e ri-pelleta i batteri a 3.000 × g per 5 minuti. Aspira il soprandante.
5. Sospezione del pellet in PBS a 1/10 del volume originale. Ad esempio, se 3 ml di OD₆₀₀ = 0,4 sono stati bloccati, allora si risospendono in 300 μl di PBS.

NOTA: Questa è l'ultima sospensione batterica (~ 1 × 10⁹ CFU/ml) utilizzata per l'inoculazione animale.

6. Riservare 50 μl di questa sospensione per diluizione seriale e placcatura su agar THB per determinare l'inoculo esatto.
7. Inoculare ogni topo con 10 μl della sospensione batterica finale in modo che vengano somministrati 1 × 10^{7 CFU} a ciascun topo.
   1. Per inoculare, immobilizzare manualmente il topo fissando la pelle flaccida sulla collina del collo tra pollice e indice del conduttore e immobilizzando la coda.
   2. Preleva 10 μl di GBS in una punta di pipetta a carico gel da 200 μl. Inserire la punta da 5 a 10 mm nel lumen vaginale e somministrare i 10 μl di inocolo.
      NOTA: Le punte a carico gel sono preferite rispetto alle punte standard da 200 μl per minimizzare il rischio di traumi o lesioni agli organi, in particolare nei topi più giovani o più piccoli.
   3. Subito dopo l'inoculazione, libera la pelle del collo e solleva la parte posteriore del topo, solleva il topo per la coda e cammina con le zampe anteriori su una superficie dura per ~ 1 minuto.
   4. Ispeziona visivamente l'apertura vaginale per eventuali riflussi di inoculo. Se si osserva un reflusso di riflusso, può essere utilizzata una punta di pipetta nuova per manipolare o ingrandire l'apertura vaginale, facilitando l'assorbimento del reflusso nel lume. Inoltre, il riflusso può essere aspirato tramite una pipetta e riinoculato.
      NOTA: Se somministrano agenti topici, organismi probiotici o proteine di interesse, può essere somministrato un volume fino a 20 μl in un tampone fisiologico nel tratto vaginale.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Punte di pipetta a carico gel da 200 μl	USA Scientific	1252-0610
Brodo di Todd Hewitt	Hardy Diagnostics	7161C
Soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbecco 1x	Corning	21-031-CV