Quantificazione della soppressione del biofilm indotta da enzimi nei batteri patogeni

Abstract

Fonte: Tay, S. B., et al. Interruzione antivirulenta dei biofilm patogeni tramite lattonasi ingegnerizzate che stingono il quorum. J. Vis. Esp. (2016)

Il video mostra un metodo per quantificare la biomassa di biofilm in un batterio patogeno, confrontando controlli non trattati con campioni trattati con un enzima quorum-quenching. L'enzima interrompe la segnalazione batterica durante l'incubazione precoce, riducendo l'adesione cellulare. Dopo il lavaggio e un'ulteriore incubazione, i pozzi di controllo formano biofilm densi, mentre i pozzi trattati mostrano una formazione ridotta. Un colorante cationico viene utilizzato per colorare il biofilm e viene misurata l'assorbanza per valutare la biomassa.

Protocollo

1. Quantificazione viola cristallina della formazione di biofilm in A. baumannii S1

1. Coltiva una coltura da 5 mL di Acinetobacter baumannii S1 (A. baumannii) in brodo di lisogenesi (LB) (triptone 10 g/L, estratto di lievito 5 g/L) a 30 °C in un incubatore agitante (220 rpm) per 16 ore.
2. Regolare la coltura di A. baumannii S1 a una densità ottica desiderata a 600 nm (OD₆₀₀) pari a 0,8. Utilizzando una piastra da 96 pozzi, inoculare la coltura batterica (diluizione 1:100) in LB fresco contenente 10 μl di enzima GKL purificato (40 mg/ml); Il volume finale della nuova cultura è di 100 μL.
3. Prepara anche una cultura di controllo; questo non conterrà alcun enzima. Ripetere condizioni simili per ottenere il numero desiderato di repliche.
4. Copri il piatto con un coperchio e mettilo in un contenitore di plastica sigillato da 10 L. Incubare il piatto a 30 °C per 3 ore prima di rimuovere delicatamente il substrato.
5. Aggiungi altri 100 μl di mezzo LB fresco al pozzo e incuba il piatto per 21 ore a 30 °C.
6. Dopo il secondo periodo di incubazione, rimuovi delicatamente tutto il substrato. Lavare la cellula batterica planctonica con acqua sterile da 200 μl. Assicurati che le cellule siano minimamente disturbate durante il lavaggio.
7. Aggiungi 100 μl di soluzione di viola cristallina all'1% in ogni pozzo e incuba per 15 minuti a temperatura ambiente. Rimuovere la soluzione di viola cristallina lavando il pozzo con acqua sterile da 200 μl. Ripeti il lavaggio altre due volte.
8. Aggiungi 100 μl di acido acetico al 33% in ogni pozzo e incuba per 15 minuti con una lieve agitazione; Questo dissolverà il colorante.
9. Quantificare la quantità di biofilm formata misurando l'assorbenza del viola cristallino a 600 nm. La quantità di viola cristallina è proporzionale alla quantità di biofilm formato.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Triptone	BD	211705
Estratto di lievito	BD	212750
Piastra a 96 pozzi	Costista	3596
Viola Cristallino	Sigma-Aldrich	C6158
Acido acetico	Scansione di laboratorio	PLA00654X	Attenzione: infiammabile
Lettore di micropiastre Synergy HT	BioTek