1. Microscopia a scansione laser confocale del biofilm S1 di A. baumannii
1. Coltivare una coltura da 5 ml di A. baumannii S1 in LB a 30 °C in un incubatore a scuotere (220 rpm) per 16 ore.
2. Regolare la coltura di A. baumannii S1 a un ODdesiderato 600 pari a 0,8. Utilizzando un vaso μ con fondo di vetro da 35 mm, inoculare la coltura batterica (diluizione 1:100) in LB fresco contenente 30 μl di enzima GKL purificato (40 mg/ml); L'ultimo volume della nuova cultura è di 1 ml.
3. Copri la piattaforma μ con un coperchio e mettila in un contenitore di plastica sigillato da 10 L. Incubare il piatto μ a 30 °C per 3 ore prima di rimuovere delicatamente il substrato. Aggiungi 30 μl di enzima GKL purificato e un mezzo fresco, portando il volume totale di 1 ml. Incubare per altre 21 ore a 30 °C.
4. Ripeti il passo 1.3 e incuba il piatto μ per altre 24 ore a 30 °C. Poi, rimuovi delicatamente i supporti.
5. Aggiungere 500 μl di 5 μg/ml di aglutinina germinale di grano (WGA) coniugata Alex Fluo 488 disciolta nella soluzione salina bilanciata di Hank (HBSS) al μDish e incubare a 37 °C per 30 minuti; questo colorerà il biofilm formato. Rimuovi la soluzione macchiante e lava il piatto μ con 2 ml di HBSS. Ripeti ancora una volta il passaggio di lavaggio.
6. Aggiungere 500 μl di formaldeide disciolto al 3,7% in HBSS e incubare a 37 °C per 30 minuti; questo fissarà il biofilm sulla μ-Dish. Lava il μDish una volta con 2 ml di HBSS e poi rimuovi completamente la soluzione. Il μ-Dish fissato con biofilm può essere conservato al buio a 4 °C prima dell'imaging CLSM.
7. Per l'imaging e l'analisi CLSM, utilizzare un ingrandimento di 63 volte per generare 97 stack per immagine con un intervallo di 0,21 μm per stack.
