Rilevamento di saccharibatteri in colture binarie tramite reazione a catena polimerasi

Abstract

Fonte: Collins, A. J., et al., Stabilire colture binarie stabili di saccharibatteri simbiotici dalla cavità orale. J. Vis. Esp. (2021)

Questo video dimostra l'uso della reazione a catena della polimerasi (PCR) per rilevare i saccharibatteri in una coltura binaria con Actinomyces. Il protocollo delinea l'amplificazione del DNA e l'elettroforesi su gel per confermare un'interazione stabile ospite-parassita.

Protocol

1. Confermare l'infezione da saccharibatteri tramite PCR
   1. Dopo 5 passataggi, confermare l'infezione con la reazione a catena della polimerasi (PCR). Cinque passaggi garantiranno che eventuali cellule di Saccharibacteria non in crescita siano state esaurite oltre il limite di rilevamento tramite 25 cicli di PCR.
   2. Prepara un master mix PCR. Una ricetta suggerita è la seguente: per ogni tubo necessario, preparare 12,5 μL 2x PCR buffer, 0,75 μL 10 μM primer frontale (580F¹² - AYT GGG CGT AAA GAG TTG C), 0,75 μL 10 μM primer inverso (1177R¹³- GAC CTG ACA TCA TCC CCT CCT TCC), 1 μL 25 mM_{MgCl 2, e 9} μL d'acqua. Mescola tramite vortice.
   3. 24 μL di master mix in un tubo PCR da 0,2 mL. Aggiungere 1 μL di coltura infettata da saccharibatteri alla reazione PCR. Inserire il tubo in un termociclatore ed eseguire il seguente protocollo: denaturazione iniziale a 95 °C per 5 minuti, 25 cicli a 95 °C per 30 secondi, 60 °C per 30 secondi, 72 °C per 30 secondi, allungamento finale a 72 °C per 2 minuti, poi mantenimento finale a 4 °C.
   4. Carica e fai girare i prodotti PCR in un gel di agarosio all'1%. Una banda di ~600 basi indicherà la presenza di Saccharibacteria.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agarose	Fisher Scientific	BP160-100
Brodo infusione Brain Heart (polvere disidratata)	Becton-Dickinson	211059	O altri mezzi di crescita adatti agli organismi bersaglio
Alimentatore per elettroforesi	Bio-Rad	1645052
Impianto per elettroforesi	Bio-Rad	1704467
GoTaq Green Mastermix	Promega	M7122
Mastercycler Pro Thermocycler	Eppendorf	950040025	O termociclatore equivalente per la PCR
Soluzione MgCl₂ 25mM	Promega	A3513
Acqua di grado biologico molecolare	Fisher Scientific	BP2819100
Micropipetta P-1000	Gilson	F123601G
Tubi PCR 0,2 mL	Fisher Scientific	14-230-205
Punte di pipetta - 1000 μL	Fisher Scientific	02-717-166
Tintura SYBR Safe DNA Gel	ThermoFisher Scientific	S33102
Brodo di soia triptico (polvere disidratata)	Becton-Dickinson	211825	O altri mezzi di crescita adatti agli organismi bersaglio