Isolamento di batteri patogeni intracellulari da cellule ospiti infette

Abstract

Fonte: Sigal, N., et al. Purificazione dell'RNA da Listeria monocytogenes coltivata intracellularmente nelle cellule macrofage. J. Vis. Esp. (2016).

Questo video dimostra l'isolamento di batteri patogeni interiorizzati da macrofagi derivati dal midollo osseo (BMDM) infetti. I batteri vengono lasciati attaccare alle cellule ospiti, mentre i batteri non attaccati vengono lavati via. Dopo l'internalizzazione, viene aggiunto un antibiotico per eliminare i batteri non interiorizzati. Le cellule ospiti vengono lisate, centrifugate e il surnatante viene filtrato per catturare i batteri su carta filtrante, che viene congelata all'improvviso e conservata per un uso successivo.

Protocollo

NOTA: Durante l'intero esperimento, le cellule macrofaghe vengono incubate a 37 °C in un incubatore ad aria forzata al 5% di_CO2 e estratte dall'incubatrice solo per manipolazioni sperimentali, che vengono eseguite in un armadio di sicurezza biologica di Classe II. Lavorare con i batteri Listeria monocytogenes è secondo le normative di sicurezza biologica di livello 2.

1. Preparazione cellulare e infezione batterica (giorni 1 e 2)

1. Giorno 1
   1. Seminare 2,0 x 10⁷ cellule macrofagiche derivate dal midollo osseo (BMDM) su un piatto da 145 mm in mezzo BMDM + Pen-Strep da 30 ml (Tabella 2). Semina 3 piastre per ogni ceppo batterico da analizzare. Incubare durante la notte a 37 °C in un incubatore ad aria forzata al 5% di CO₂ .
   2. Inizia una coltura batterica notturna del ceppo selvatico (WT) di L. monocytogenes 10403S in 10 ml di mezzo per infusione cardiaca cerebrale (BHI), a 30 °C in un incubatore standard. Posiziona i tubi di coltura inclinati senza scuotire.
      NOTA: Queste condizioni di crescita aumentano l'espressione dei geni dei flagelli, favorendo un'infezione efficiente.
2. Giorno 2
   1. Mezzo BMDM pre-riscaldato (senza antibiotici Pen-Strep) (Tabella 2) e soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) a 37 °C.
   2. Lavare due volte il monostrato di macrofagi con 25 ml di PBS preriscaldato per rimuovere gli antibiotici. Aggiungi 30 ml di medium BMDM fresco.
   3. Lavare 1,5 ml di coltura batterica notturna con PBS centrifugando i batteri a > 14.000 x g per 1 minuto, scartando il soprantantante e risospendendo delicatamente i batteri in 1,5 ml di PBS tramite pipetta. Ripeti due volte.
   4. Infettare ogni lama macrofagica con 0,5 ml di una coltura lavata durante la notte di L. monocytogenes di tipo selvatico. Se usi più piatti, infetta ogni piastra a distanza di 15 minuti. Questo intervallo permetterà di prelevare ogni piastra individualmente alla fine dell'infezione.
      NOTA: La molteplicità dell'infezione (MOI) viene misurata tramite placcatura di diluizioni seriali di colture batteriche utilizzate per l'infezione su piastre agar BHI e conteggio delle unità formative di colonie (CFU) dopo un'incubazione di 24 ore di placche a 37 °C. L'uso di 0,5 ml di WT L. monocytogenes ceppo 10403S si ottiene un MOI di ~ 100 (100 CFU batterici per cellula macrofago). Quando si analizzano mutanti batterici difettosi nella crescita intracellulare, si dovrebbe considerare un MOI più elevato.
   5. Dopo un'incubazione di 0,5 ore a 37 °C, lavare due volte le cellule infette con PBS per rimuovere i batteri non attaccati, e aggiungere 30 ml di mezzo BMDM preriscaldato. I batteri attaccati interiorizzeranno durante le successive 0,5 ore.
   6. A un'ora dall'infezione, si aggiungono 30 μl di gentamicina (1:1.000 per raggiungere una concentrazione finale di 50 μg/ml) per uccidere i batteri extracellulari.
   7. Assemblare l'apparato filtrante posizionando una testa filtrante su una fiaschetta di liquido raccoglitrice con una porta di uscita a vuoto. Poi si posiziona un filtro (0,45 μm) su una testa filtrante, seguito da un imbuto a cilindro e si fissano le diverse parti con una pinza metallica. Prepara acqua fredda e senza RNasi.
   8. A 6 ore dall'infezione, preleva i batteri dalle cellule infette come segue. Tratta ogni piatto singolarmente.
      NOTA: Di solito, L. monocytogenes completa 1-log di crescita durante 6 ore di infezione nelle cellule macrofagiche. Incubazioni più lunghe potrebbero causare una crescita eccessiva batterica e la morte cellulare dei macrofagi, mentre periodi di incubazione più brevi potrebbero comportare carichi batterici considerevolmente inferiori. Il MOI e il momento dell'infezione possono essere modificati per raggiungere condizioni ottimali.
      1. Lava le cellule infette con PBS una volta. Aggiungi 20 ml di acqua fredda e senza RNasi per lisare le cellule dei macrofagi. Usando un raschiatore a celle, raschia rapidamente ma con attenzione le celle dalla placca.
      2. Raccogli cellule lisate in un tubo conico da 50 ml. Vortice per 30 secondi. Centrifuga a 800 x g per 3 minuti a 4 °C.
      3. Far passare il sovrantantante attraverso l'apparecchiatura di filtrazione utilizzando un sistema a vuoto. Con una pinzetta, rotoli il filtro e trasferiscilo rapidamente in un tubo conico da 15 ml. Congelare rapidamente i tubi con i filtri in azoto liquido.
      4. Assemblare l'apparecchio di filtrazione con un nuovo filtro per il campione successivo, come descritto nella 1.2.7.
      5. Conserva i filtri congelati a -80 °C per il giorno successivo. In alternativa, procedere direttamente all'estrazione degli acidi nucleici.

Tabella 1: Protocollo di reazione DNasi.

RNA	fino a 2 μg (nel volume massimo di 44 μl)
Buffer DNasi 10x	5 μl
Acqua priva di RNasi	Completo fino a 50 μL di volume totale
DNAse	1 μl (1 unità)

Tabella 2: Ricette di Media e Buffer.

1. 500 ml di substrato BMDM+Pen-Strep (sterilizzato con filtro):
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	235 ml
Siero bovino fetale (FBS) (inattivato 30 minuti a 54 °C)	100 ml
Fattore stimolante della colonia di macrofagi o M-CSF (mezzo condizionato L-929)	150 ml
Glutamina	5 ml
Piruvato di sodio	5 ml
β-Mercaptoetanolo	0,5 ml
Penicillina/Streptomicina	5 ml
Totale	500 ml
2. 500 ml BMDM (sterilizzato con filtro):
DMEM	235 ml
FBS (inattivato 30 min a 54 °C)	100 ml
M-CSF (mezzo condizionato L-929)	150 ml
Glutamina	5 ml
Piruvato di sodio	5 ml
β-Mercaptoetanolo	0,5 ml
Totale	500 ml
3. Buffer AE
Acetato di sodio (NaOAc) pH 5,2	50 mM
Acido etilendediaminatetraacetico (EDTA)	10 mM
Acqua priva di RNasi
4. fenolo-cloroformio-IAA
Fenolo	25 ml
Cloroformio	24 ml
Iso-amil alcol	1 ml
5. cloroformio-IAA
Cloroformio	24 ml
Iso-amil alcol	1 ml

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Listeria monocytogenes 10403S
Macrofagi derivati dal midollo osseo preparati da topi femmine C57B/6
H₂O, RNAse	Thermo Scientific	10977-015	Si può utilizzare acqua trattata con DEPC
DMEM	Gibco	41965039
Glutamina	Gibco	25030081
Piruvato di sodio	Gibco	11360-088
β-Mercaptoetanolo	Gibco	31350010
Pen/Streptococco	Gibco	15140-122
Gentamicina	Sigma-Aldrich	G1397
FBS	Gibco	10270106
Soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbecco-PBS	Sigma-Aldrich	D8537
Infusione cerebrale e cardiaca (BHI)	Merckmillipore	1104930500
Acetato di sodio	Sigma-Aldrich	W302406
EDTA	Sigma-Aldrich	EDS
Assoluto dell'etanolo	Merck Millipore	1070174000
Incubatore ad aria forzata 37 °C, 5% di CO₂	Thermo Scientific	Modello 3111
Raschietti a celle	Nunc	179693
Portavetro Kontes per filtri da 45 mm	Fisher	K953755-0045
Filtri MF-Millipore 45 mm, 0,45 μm	Merck Millipore	HAWP04700
Sistema SpeedVac	Thermo Scientific	SPD131DDA
Vortex-Genie 2	Industrie scientifiche	Modello G560E
Vasi di coltura cellulare da 145 mm	Greiner	639 160
Tubi da 1,7 ml, senza RNasi	Assigeno	MCT-175-C
Centrifuga da tavolo a 4 °C	Eppendorf	5417R
Pipette sterili, 25 ml	Greiner
Tubi Falcon, 50 ml	Greiner