Isolamento di batteri patogeni intracellulari da cellule ospiti infette

Abstract

Fonte: Sigal, N., et al. Purificazione dell'RNA da Listeria monocytogenes coltivata intracellularmente nelle cellule macrofage. J. Vis. Esp. (2016).

Questo video dimostra l'isolamento di batteri patogeni interiorizzati da macrofagi derivati dal midollo osseo (BMDM) infetti. I batteri vengono lasciati attaccare alle cellule ospiti, mentre i batteri non attaccati vengono lavati via. Dopo l'internalizzazione, viene aggiunto un antibiotico per eliminare i batteri non interiorizzati. Le cellule ospiti vengono lisate, centrifugate e il surnatante viene filtrato per catturare i batteri su carta filtrante, che viene congelata all'improvviso e conservata per un uso successivo.

Protocollo

NOTA: Durante l'intero esperimento, le cellule macrofaghe vengono incubate a 37 °C in un incubatore ad aria forzata al 5% di_CO2 e estratte dall'incubatrice solo per manipolazioni sperimentali, che vengono eseguite in un armadio di sicurezza biologica di Classe II. Lavorare con i batteri Listeria monocytogenes è secondo le normative di sicurezza biologica di livello 2.

1. Preparazione cellulare e infezione batterica (giorni 1 e 2)

1. Giorno 1
   1. Seminare 2,0 x 10⁷ cellule macrofagiche derivate dal midollo osseo (BMDM) su un piatto da 145 mm in mezzo BMDM + Pen-Strep da 30 ml (<....

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Listeria monocytogenes 10403S
Macrofagi derivati dal midollo osseo preparati da topi femmine C57B/6
H₂O, RNAse	Thermo Scientific	10977-015	Si può utilizzare acqua trattata con DEPC
DMEM	Gibco	41965039
Glutamina	Gibco	25030081
Piruvato di sodio	Gibco	11360-088
β-Mercaptoetanolo	Gibco	31350010
Pen/Streptococco	Gibco	15140-122
Gentamicina	Sigma-Aldrich	G1397
FBS	Gibco	10270106
Soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbecco-PBS	Sigma-Aldrich	D8537
Infusione cerebrale e cardiaca (BHI)	Merckmillipore	1104930500
Acetato di sodio	Sigma-Aldrich	W302406
EDTA	Sigma-Aldrich	EDS
Assoluto dell'etanolo	Merck Millipore	1070174000
Incubatore ad aria forzata 37 °C, 5% di CO₂	Thermo Scientific	Modello 3111
Raschietti a celle	Nunc	179693
Portavetro Kontes per filtri da 45 mm	Fisher	K953755-0045
Filtri MF-Millipore 45 mm, 0,45 μm	Merck Millipore	HAWP04700
Sistema SpeedVac	Thermo Scientific	SPD131DDA
Vortex-Genie 2	Industrie scientifiche	Modello G560E
Vasi di coltura cellulare da 145 mm	Greiner	639 160
Tubi da 1,7 ml, senza RNasi	Assigeno	MCT-175-C
Centrifuga da tavolo a 4 °C	Eppendorf	5417R
Pipette sterili, 25 ml	Greiner
Tubi Falcon, 50 ml	Greiner