Estrazione di RNA da Listeria monocytogenes raccolta da macrofagi murini infetti

Abstract

Fonte: Sigal, N., et al. Purificazione dell'RNA da Listeria monocytogenes coltivata intracellularmente nelle cellule macrofage. J. Vis. Esp. (2016)

Questo video dimostra l'estrazione di RNA da Listeria monocytogenes isolata da macrofagi murini infetti. Il protocollo preserva l'RNA, lisa le cellule usando fenolo-cloroformio e calore, e separa l'RNA tramite centrifugazione. Sale ed etanolo, combinati con l'incubazione a freddo, favoriscono la precipitazione dell'RNA. L'RNA risultante cattura l'espressione genica indotta dall'ospite, rivelando la virulenza batterica e le strategie di adattamento.

Protocollo

1. Estrazione degli acidi nucleici

NOTA: Esegui tutte le manipolazioni con soluzioni di fenolo e cloroformio in una cappa a fumo.

1. Prepara una miscela 1:1 di fenolo acidificato: cloroformio, 400 μl per ogni campione. Mescola in tubi separati e poi estrai lo strato acquoso risultante tramite aspirazione. Aggiungi 40 μl di SDS al 10%.
2. Scongela i tubi contenenti il filtro sul ghiaccio per mantenerli freddi. A ogni tubo contenente filtro aggiungere 650 μl di tampone acetato-EDTA (AE) (50 mM NaOAc pH 5,2, 10 mM EDTA, acqua senza RNasi).
3. Esegui i seguenti passaggi il più rapidamente possibile.
   1. Vortice vigorosamente il tubo contenente il filtro in modo che il filtro sbatta alla periferia del tubo e il buffer lavi completamente il filtro. Tieni sempre il tubo freddo rimettendolo sul ghiaccio.
      NOTA: Potrebbe essere necessario inoltre far vortice nel tubo mentre è rovesciato per lavare completamente i batteri dal filtro.
   2. Ripeti per tutti i tubi. Può essere utile spegnere la sospensione brevemente (1 minuto a 120 x g) alla fine del processo.
4. Trasferire il tampone contenente batteri in un tubo microcentrifuga da 1,5 ml contenente la miscela SDS e fenolo/cloroformio. Ripeti per tutti i tubi. Potrebbe essere necessario far ruotare nuovamente i tubi contenenti il filtro (1 minuto a 120 x g) per ottenere il residuo di buffer dal filtro.
5. Metti tutti i tubi da 1,5 ml in un dispositivo a vortice multi-tubi e fai il vortice a piena velocità per 10 minuti.
6. Incubare i tubi in un blocco termico a 65 °C per 10 minuti. Centrifugare alla velocità massima (> 14.000 x g) per 5 minuti.
7. Trasferire lo strato acquoso (circa 400 μl) da ogni tubo a un nuovo tubo da 1,5 ml contenente 40 μl di 3 M di acetato di sodio (pH 5,2) e 1,0 ml di etanolo al 100%. Vortice accuratamente ogni tubo.
   NOTA: Il glicogeno può essere aggiunto in questa fase per migliorare la visualizzazione del pellet precipitato.
8. Incubare i campioni a -80 °C per 1 ora. In alternativa, incubare i campioni a -20 °C durante la notte. Poi, centrifugare i campioni a 4 °C per 20 minuti alla velocità massima (> 14.000 x g).
9. Aspira con attenzione dallo strato di etanolo (superiore strato) da ogni provetta. Aggiungi 500 μl di etanolo freddo al 70% a ciascun campione e vortice a fondo. Centrifugare a 4 °C per 20 minuti alla velocità massima (> 14.000 x g).
10. Aspira con cura l'etanolo da ogni provetta. Asciuga i campioni per circa 2 minuti usando un evaporatore a vuoto senza calore. Non asciugare troppo i campioni.
11. Aggiungi 25 μl di acqua priva di RNasi a ogni campione. Incubare a temperatura ambiente per 20 minuti. Vortice e spin-down con attenzione.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Listeria monocytogenes 10403S
H2O, senza RNAse	Thermo Scientific	10977-015	Si può utilizzare acqua trattata con DEPC
pH saturo di fenoli 4,3	Fisher	BP1751I-400
Cloroformio	Fisher	BP1145-1
Iso-amil alcol	Sigma-Aldrich	W205702
Acetato di sodio	Sigma-Aldrich	W302406
EDTA	Sigma-Aldrich	EDS
SDS 10%	Sigma-Aldrich	L4522
Assoluto dell'etanolo	Merck Millipore	1070174000
Filtri MF-Millipore 45 mm, 0,45 μm	Merck Millipore	HAWP04700
Vortex-Genie 2	Industrie scientifiche	Modello G560E
Blocco termico a 65 °C	Thermo Scientific
Centrifuga da tavolo a 4 °C	Eppendorf	5417R
Pipette sterili, 25 ml	Greiner
Tubi Falcon, 50 ml	Greiner
Tubi da 1,7 ml, senza RNasi	Assigeno	MCT-175-C
Sistema SpeedVac	Thermo Scientific	SPD131DDA