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Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato locale istituzionale per la cura degli animali e dal comitato veterinario JoVE.
1. Preparazione dell'inoculo batterico per Escherichia coli (UPEC) uropatogeno
- Preparare infezioni delle vie urinarie89 (UTI89) inoculo (iniziare 72 ore prima del giorno dell'inoculazione)
- Sfila UTI89 su una piastra di agar LB (Luria-Bertani) da un calcio congelato. Incubare durante la notte a 37 °C. Scegliere una colonia e inocularla in 10 ml di LB in una fiaschetta da 125 ml. Incubare a 37 °C per 24 ore, in modo statico.
- Inoculare 10 μl di coltura notturna in 10 ml di LB in una nuova fiaschetta da 125 ml per ulteriori 24 ore a 37 °C, in modo statico.
- Trasferire 3 ml (varierà in base al ceppo e alla dimensione dell'inoculo desiderato) in tubi sterili da 1,5 ml e centrifugare a 7.000 g per 3 minuti, poi risospendere il pellet in 1x soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) e centrifugare una seconda volta. Risospendi il pellet batterico in 1 mL 1x PBS.
- Misurare la densità ottica batterica e regolare la concentrazione in base alla densità dell'inoculo desiderata. La concentrazione standard dell'inoculo utilizzato è di10,7 batteri; tuttavia, questo può variare a seconda del design dello studio.
2. Inoculazione batterica
- Pulisci la postazione con etanolo al 70% e copri l'area con carta assorbente (oppure usa una cappa a flusso sterile).
- Preleva fino a 0,9 ml dell'inoculo batterico preparato in una siringa di tubercolina (TB) da 1 ml (rimuovi le bolle d'aria). Attacca un ago di inoculazione sterile preparato con polietilene con una dimensione 10 (PE10) tubi sulla siringa contenente l'inoculo, poi rifila sterilmente il tubo in polietilene.
NOTA: Lascia 1 mm di tubo sopra la punta dell'ago per evitare di perforare la vescica. - Taglia un pezzo quadrato di parafilm da 1 pollice e metti sopra un po' di lubrificante chirurgico (circa della dimensione di una moneta da dieci centesimi).
- Anestetizzare le femmine di topi C3H/HeN mettendole in una camera di vaporizzatore (seguendo il protocollo del produttore) fino a quando non sono incoscienti ma respirano normalmente (1 respiro al secondo).
ATTENZIONE: L'isoflurano è un anestetico inalatorio. Da usare in un'area ben ventilata e ridurre al minimo l'inalazione. - Togli il topo dal vaporizzatore e mettilo sulla schiena su un tovagliolo di carta e allarga le gambe.
- Copri il naso del topo con un cono nasale (un tubo collegato al vaporizzatore che fornisce una dose controllata di isoflurano fornita su alcuni dispositivi di vaporizzatore) per mantenere l'anestetismo.
- Palpa delicatamente la vescica per indurre la minzione e assicurarti di evacuare la vescica. Pulisci l'area periuretrale con una salvietta al 100% etanolo. Tampona l'ago/siringa di inoculazione, punta prima, nel lubrificante chirurgico.
- Inoculare ogni topo con 50 μl della soluzione batterica inserendo l'ago di inoculazione in modo transuretrale, circa 12 mm, e premendo delicatamente lo sturalavandini per emettere l'inoculo nella vescica (10 μl/sec). Rimuovi l'ago di inoculazione dal topo.
NOTA: Il ritorno immediato dell'inoculo all'apertura dell'uretra quando si inizia l'inoculazione indica un'inserzione impropria o incompleta dell'ago. - Togli il topo dal cono nasale e rimettilo nella gabbia. Ripeti i passaggi 2.3-2.8 per ogni mouse. Quando/se si cambiano condizioni/ceppi di inoculo, getta la siringa e l'ago di inoculazione in un contenitore approvato per taglienti e ricomincia dal passo 2.2.
NOTA: L'inoculazione con organismi uropatogeni generalmente non causa sintomi dolorosi gravi. Tuttavia, in rari casi, la somministrazione di dosi elevate di patogeni può causare febbre, riduzione dell'assunzione di cibo e acqua e comportamenti anomali. La salute animale dovrebbe essere monitorata durante tutto l'esperimento. Se si manifestano sintomi di dolore evidenti, può essere applicato un analgesico, come la Buprenorfina (0,05−0,1 mg/kg somministrata sottocutanea).
3. Enumerazione delle comunità batteriche intracellulari (IBC)
- Rimuovi asetticamente la vescica e mettila in 1x PBS in una piastra a 6 pozzi con fondo in silicone. Le lastre possono essere preparate utilizzando un kit di elastomero in silicone e versando circa 1 cm di silicone in ciascun pozzo. Taglia la vescica a metà usando delle forbici.
- Usando piccoli perni metallici, allarga delicatamente la vescica in modo che il lumen della vescica sia rivolto verso l'alto. Assicurati di posizionare i perni ai bordi più esterni delle sezioni della vescica per garantire che la massima quantità di urotelio venga esposta.
- Dopo aver spalmato, lava delicatamente la vescica una volta con 1x PBS. Rimuovi il PBS 1x con la pipetta. Correggi la vescica aggiungendo abbastanza paraformaldeide al 3% da coprire tutta la vescica spalmata.
ATTENZIONE: Il paraformaldeide è cancerogeno. Devono essere indossati sempre dispositivi di protezione adeguati, inclusi i guanti. La smaltimento dovrebbe seguire le linee guida istituzionali. - Incubare a temperatura ambiente per 1 ora. Rimuovi la soluzione di paraformaldeide. Lava una volta con 1x PBS.
- Lava con la soluzione di lavaggio LacZ (2 mM diMgCl 2, 0,01% di sodio desossicolato e 0,02% di nonidet-p40 in 1x PBS) tre volte per 5 minuti per ogni lavaggio.
- Rimuovere la soluzione di lavaggio e aggiungere abbastanza tinta LacZ (9,5 ml di soluzione di lavaggio LacZ, 0,4 ml 25 mg/ml X-gal e 0,1 ml di 100 mM di K-ferrocianuro/K-ferricianuro) per coprire le vesciche. Incubare a 30 °C durante la notte protetto dalla luce.
- Rimuovere le vesciche divaricate dall'incubatrice e osservare gli IBC, che appaiono come punti blu visualizzati con un telescopio dissezionale, ingrandimento 40-60X.
NOTA: A volte un topo può urinare prima che il tubo venga posizionato sotto l'uretra. In questo caso, aspetta 15-20 minuti prima di tentare di raccogliere di nuovo l'urina.