Stabilire un modello murino delle infezioni da ustioni con batteri patogeni

Abstract

Fonte: Wang, Y., et al. In vivo Indagine della terapia antimicrobica con luce blu per infezioni da ustioni da Acinetobacter baumannii multi-resistente a farmaci utilizzando immagini a bioluminescenza. J. Vis. Esp. (2017)

Questo video mostra come stabilire un'infezione da ustioni in un modello murino applicando un blocco di ottone riscaldato seguito da un inoculo batterico patogeno. I batteri colonizzano la matrice extracellulare esposta e formano un biofilm, permettendo studi in vivo sulle interazioni ospite-patogeno.

Protocollo

Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato locale istituzionale per la cura degli animali e dal comitato veterinario JoVE.

1. Modello murino di infezione da ustioni causata da Acinetobacter baumannii bioluminescente

1. Usa topi femmine adulte BALB/c di età 7-8 settimane e con un peso di 17-19 g. Lascia che i topi si abituino alle condizioni di laboratorio per almeno 3 giorni prima dell'inizio dell'esperimento. Mantieni i topi in un ciclo di 12 ore chiaro/buio a una temperatura ambiente di 21 °C e dai loro cibo e acqua ad libitum.
2. Anestetizzare i topi con un'iniezione intraperitoneale di un cocktail ketamina-xilazina (100 mg/kg-20 mg/kg). Toccare leggermente la palpebbra di ogni topo con un cotton fioc; L'assenza del riflesso palpebrale suggerisce una profondità anestetica adeguata. Copri gli occhi del topo con un unguento veterinario per evitare che si secchi durante l'anestesia.
3. Rasi i topi sulla schiena per esporre quanta più pelle possibile usando un tagliacapelli da 50 lame.
4. Posiziona il coperchio di una piastra di Petri da 35 mm sotto l'addome di ogni topo per mantenere la schiena relativamente orizzontale.
5. Fai bollire l'acqua in un becher da 250 mL (80% pieno) utilizzando una piastra elettrica a corrente alternata (VAC) da 10" x 10", 220 volt. Immergere un blocco di ottone (sezione trasversale di 1 cm x 1 cm) nel becher fino a raggiungere l'equilibrio termico con l'acqua. L'equilibrio termico di solito richiede <5 minuti ed è indicato dal ribollire dell'acqua nel becher.
6. Prima di creare la lesione da ustione, somministrare analgesici preventivi (un'iniezione sottocutanea di 0,1 mg/kg di buprenorfina) per alleviare il dolore.
7. Dieci minuti dopo gli analgesici preventivi, premere delicatamente il blocco di ottone riscaldato sulla zona rasata sulla schiena dei topi per 7 secondi per indurre le ustioni.
   NOTA: Per evitare danni termici al personale di lavoro, indossa guanti resistenti al calore durante la procedura di combustione.
8. Somministrare 0,5 mL di soluzione salina sterile tramite iniezione sottocutanea per prevenire la disidratazione.
9. Cinque minuti dopo l'indotta lesione termica, inoculare 50 μL di sospensione batterica contenente 5 unità formanti colonie (CFU) da 10⁶ in soluzione salina tamponata fosfato (PBS) sulle ustioni del topo usando una pipetta. Poi, usando un cotton fioc sterile in movimento a zigzag sulla pelle, spalma le aliquote sulle ustioni per distribuire le cellule batteriche nell'area bruciata nel modo più uniforme possibile.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Mouse	Laboratori Charles River, Wilmington, MA	BALB/c	7-8 settimane di età, peso 17-19 g
Acinetobacter baumannii	Centro Medico Militare Brooke, Fort Sam Houston, TX	Isolato clinico	Ceppo luminescente ingegnerizzato
Siringhe per insulina	Fisher Scientific	14-826-79	Siringhe di insulina BD Lo-Dose U-100 per iniezione
Cloruro di sodio	Fisher Scientific	721016	0,9% di cloruro di sodio
Soluzione salina tamponata con fosfato, soluzione 1x	Fisher Scientific	BP24384	Un tampone fosfato standard utilizzato in molte procedure biomolecolari
Anelli inoculanti	Fisher Scientific	22-363-605	Per spalmare inoclium batterico sulla superficie di ustione dei topi
Blocco in ottone	Small Parts, Inc., Miami, FL	10 mm per 10 mm	Per la creazione di ustioni nei topi
Guanti ad alta temperatura Extreme Dragon PBI/Kevlar	Superior Glove Works Ltd, Cheektowaga, NY	PBI83514	Guanti resistenti al calore
Piatti Greiner	Sigma-Aldrich Co. LLC	P5112-740EA	35 mm ×10 mm
Piastra calda digitale Corning	Cole-Parmer Instrument Company, LLC	UX-84301-65	10" x 10", 220 VAC, per acqua bollente
Letto chirurgico riscaldato ad acqua sottile per topi/ratti	Sistemi E-Z	EZ-211	Previene la perdita di calore e l'ipotermia durante l'intervento chirurgico
Pomata veterinaria	S&K Pharma, GmbH	Kerato Biciron 5%, Augensalbe	Pomata optalmica per prevenire la secchezza oculare