Imaging bioluminescente delle ustioni infettate da Acinetobacter baumannii nei topi

Abstract

Fonte: Wang, Y., et al. In vivo Indagine della terapia antimicrobica con luce blu per infezioni da ustioni da Acinetobacter baumannii multi-resistente a farmaci utilizzando immagini a bioluminescenza. J. Vis. Esp. (2017)

Questo video mostra la procedura per l'imaging delle infezioni da ustioni nei topi inoculati con Acinetobacter baumannii che trasportano un operone bioluminescente. Dimostra come l'ossidazione del substrato catalizzato dalla luciferasi produca luce proporzionale al carico batterico, consentendo un monitoraggio in tempo reale della progressione dell'infezione utilizzando un sistema di imaging bioluminescenze.

Protocollo

Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato locale istituzionale per la cura degli animali e dal comitato veterinario JoVE.

1. Imaging bioluminescente delle infezioni nei topi

1. Immagini i mouse utilizzando un sistema di imaging a scarsa luce che include una fotocamera con dispositivo a carica intensificata accoppiata, un controller per fotocamere, una camera per campioni e un processore di immagini.
2. Anestesiare i topi con un'iniezione intraperitoneale di un cocktail ketamina-xilazina (100 mg/kg - 20 mg/kg). Toccare leggermente il palpebrale dei topi con un cotton fioc; L'assenza del riflesso palpebrale suggerisce una profondità anestetica adeguata.
3. Avvia il software di imaging live. Nel pannello di controllo che appare, clicca su Inizializza. Aspettare che il colore della scatola di temperatura diventi verde, indicando che la temperatura dello stadio nella camera del campione ha raggiunto i 37 °C.
4. Posizionare i topi sul palco (37 °C) nella camera del campione del sistema di imaging, con le ustioni infette direttamente sotto la telecamera.
   NOTA: La bioluminescenza dei batteri potrebbe diminuire quando le ustioni si asciugano. Pertanto, si consiglia di idratare le ustioni del topo con PBS prima dell'immagini.
5. Nel pannello di controllo, metti un segno di spunta accanto a "Luminescenza." Seleziona "Esposizione automatica" in modo che il tempo di esposizione per l'imaging venga ottimizzato dal software di imaging live in base all'intensità della bioluminescenza.
6. Seleziona "C" dalla lista a tendina "Campo di Vista". Seleziona l'opzione "Scansiona la gamma media" per lasciare che il software determini la distanza focale. Metti un segno di spunta accanto a Overlay.
7. Clicca su "Acquisire" per catturare l'immagine. Nella casella "Modifica Etichetta Immagine", clicca su "OK"; appariranno una "Finestra Immagine" e una "Palette Toll".
8. Imposta parametri di ROI automatico per la selezione automatica.
9. Quantificare l'intensità della bioluminescenza come unità relative di luminescenza (RLU) e mostrare la bioluminescenza in una scala di falsi colori che va dal rosa (più intenso) al blu (meno intenso).
10. Calcola la frazione di sopravvivenza dei batteri nelle ustioni di topo in diversi momenti basandosi sull'analisi dell'intensità della bioluminescenza. La frazione di sopravvivenza dei batteri in un dato momento = l'intensità della bioluminescenza misurata in quel momento / l'intensità della bioluminescenza misurata subito prima dell'esposizione alla luce blu antimicrobica.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
IVIS	PerkinElmer Inc, Waltham, MA	IVIS Lumina Serie III	Imaging preclinico in vivo
LED a diodo a emissione luminosa	VieLight Inc, Toronto, Canada	415 nm	Sorgente luminosa per l'illuminazione
Mouse	Laboratori Charles River, Wilmington, MA	BALB/c	7-8 settimane di età, peso 17-19 g
Acinetobacter baumannii	Centro Medico Militare Brooke, Fort Sam Houston, TX	Isolato clinico	Ceppo luminescente ingegnerizzato
Piatti Greiner	Sigma-Aldrich Co. LLC	P5112-740EA	35 mm ×10 mm