Somministrazione mediata da agrobatterio di cloni virali ricombinanti nelle piantine di mais per silenziamento genico

Abstract

Fonte: Beernink, B. M. et al. Agroinoculazione diretta di piantine di mais tramite iniezione con cloni infettivi del virus del mosaico della coda di volpe e del virus del mosaico della canna da zucchero. J. Vis. Esp. (2021)

Questo video dimostra la somministrazione mediata da Agrobacterium di cloni virali ricombinanti nelle piantine di mais per il silenziamento genico. Descrive il processo di infezione da Agrobacterium , la diffusione sistemica del virus e i cambiamenti fenotipici guidati dall'interferenza dell'RNA.

Protocollo

1. Iniezione
NOTA: Le piantine di mais di 4-7 giorni di vita possono essere utilizzate per iniezione. Il tasso di crescita delle piantine è fortemente influenzato dalle condizioni di crescita, dalla quantità di radiazione fotosinteticamente attiva (PAR) (cioè un PAR più alto in serra rispetto alla camera di crescita) e dal genotipo, tra le altre cose che possono essere difficili da controllare in condizioni di serra. Le piante possono essere iniettate già a 4 giorni, quando sono alte 2-3 cm senza foglie espanse, e fino a 7 giorni quando la foglia più bassa con la punta arrotondata è espansa. Il tasso di successo di questo metodo di inoculazione diminuisce rapidamente man mano che le piante invecchiano oltre i 7 giorni dalla semina. Il sito di iniezione è lo stesso indipendentemente dall'età delle piantine.

1. Indossando occhiali di sicurezza, iniettare la sospensione batterica nelle piantine 2-3 mm sopra il nodo coleoptilare usando un ago da 25G x 5/8" fissato a una siringa usa e getta da 1 mL.
   NOTA: Il nodo coleottile è dove alla fine si formeranno le radici della corona. Questo è il nodo più basso dell'impianto. Tipicamente, il colore cambia dal verde al bianco a livello e sotto il nodo. Il punto di iniezione è appena sopra il meristem. Dissezionare alcune piantine in questa fase può aiutare a visualizzare la posizione del meristemo e di conseguenza il sito di iniezione corretto.
2. Applica una pressione delicata sulla siringa finché la sospensione non riempie il coleottilo o non è visibile nel vorticolo, a seconda dello stadio di crescita delle piante. Si tratta di circa 100-200 μL di sospensione.
   NOTA: Se è difficile iniettare la sospensione nella piantinna, il sito di iniezione potrebbe essere troppo basso. Una pressione moderata è sufficiente per iniettare la sospensione.
3. Iniettare tutte le piantine cambiando siringhe e aghi per ogni costrutto.

2. Cura continua delle piante

1. Trapianta le piantine iniettate in vasi di 13 x 13 x 15 cm o più grandi quando avranno 7-8 giorni.
2. Mantenere le condizioni di crescita (fotoperiodo di 16 ore e concimazione una volta a settimana).

3. Conferma dell'infezione (fenotipicamente)

1. Il punteggio fenotipico delle piante tra i 14 e i 21 giorni dopo l'inoculazione (DPI). Le lesioni dovute al silenziamento dei geni di controllo della lesione mimica 22 o fitoene desaturasi possono essere facilmente osservate sulle foglie e sono distinte dai sintomi di FoMV.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Siringhe da 1 mL	Fisher Scientific	14955450	in alternativa, BD 309659
Ceppo di Agrobacterium tumefaciens GV3101			Trasporta plasmidi di vir che codifica per macchinari di trasferimento T-DNA, RifR, GmR, provenienti da materiale di laboratorio
Fertilizzante			Peters Fertilizzer 15-15-15 Concentrato
Vasi Grandi	Kordlok	SQL0550	5x5x4" o più grande. Per trapianto piantine.
Semi di mais dolce Golden Bantam	Prato americano, semi della costa occidentale
Substrato del suolo	Orticoltura SunGro	SS#1-F1P	Miscela per il sole #1/Fafard-1P, qualsiasi miscela di terreno in cui il mais cresca bene è sufficiente