Stabilimento di biofilm trasversali batterico-fungini per lo studio della patogenesi orale

Abstract

Fonte: Schlafer, S, e Frost Kristensen, M. Monitoraggio del pH extracellulare in biofilm cross-regni utilizzando microscopia confocale. J. Vis. Esp. (2020)

Questo video dimostra la coltivazione di biofilm cross-regno di Streptococcus mutans e Candida albicans in condizioni simili a quelle orali per modellare le interazioni batterico-fungine, permettendo lo studio della sinergia microbica, dell'adesione mediata dal glucano e della virulenza acidogenica nella patogenesi orale.

Protocollo

Tutte le procedure relative alla raccolta dei campioni sono state eseguite in conformità con le linee guida IRB dell'istituto.

1. Coltivazione di biofilm trans-regni

1. Coltivare Streptococcus mutans (S. mutans) DSM 20523 e Candida albicans (C. albicans) NCPF 3179 su placche di agar sanguigna a 37 °C in condizioni aerobiche.
2. Trasferire singole colonie di ciascun organismo in provette riempite con 5 mL di infusione cerebrale cardiaca (BHI). Coltivare per 18 ore in condizioni aerobiche a 37 °C.
3. Centrifuga le colture notturne a 1.200 x g per 5 minuti. Scartare il soprandante, risospendere le cellule in soluzione fisiologica salina e regolare il OD_{550 nm} a 0,5 per C. albicans (~10⁷ cellule/mL) e S. mutans (~10⁸ cellule/mL). Diluire la sospensione di S. mutans 1:10 con soluzione fisiologica sterile (~10⁷ cellule/mL).
4. Pipetta 50 μL di soluzione salivale sterile, nei pozzi di una lastra ottica a fondo di 96 pozzi per la microscopia. Incubare per 30 minuti a 37 °C. Lavare i pozzi 3 volte con 100 μL di soluzione fisiologica sterile. Svuota i pozzi.
5. Aggiungi 100 μL di sospensione di C. albicans in ogni pozzo. Incubare a 37 °C per 90 minuti. Lava 3 volte con soluzione fisiologica sterile.
   NOTA: Non svuotare completamente i pozzi durante il lavaggio. Lasciare un serbatoio di 20 μL per evitare forze di taglio eccessive.
6. Aggiungere 100 μL di siero fetale bovino inattivato al calore (inattivato a 56 °C per 30 minuti) in ciascun pozzo. Incubare a 37 °C per 2 ore. Lava 3 volte con soluzione fisiologica sterile. Svuotare i pozzi, lasciando un serbatoio di 20 μL.
7. Aggiungere 100 μL di sospensione S. mutans (preparata nel passaggio 1.3) a ciascun pozzo. Aggiungi 150 μL di BHI contenente il 5% di saccarosio. Incubare a 37 °C per 24 ore o più. Quando si coltivano biofilm più vecchi, cambia quotidianamente il mezzo in BHI fresco. Alla fine della fase di crescita del biofilm cross-kingdom, lavare 5 volte con soluzione fisiologica sterile.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Piastre di agar di sangue	Statens Serum Institut	677
Infusione cerebrale cardiaca	Ossassoide	CM1135
Infusione cerebrale e cardiaca + 5% saccarosio	Forniture di laboratorio BDH	10274
Candida albicans	Collezione Nazionale di Funghi Patogeni	NCPF 3179
Siero bovino fetale	Tecnologie Gibco Life	10270
Centrifuga refrigerata GS-6R	Beckman	N/A
μ-Plate 96 Well Black	Ibidi	89626
Soluzione fisiologica sterile	VWR	6404
Streptococcus mutans	Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen	DSM 20523
Vis-spettrofotometro V-3000PC	VWR	N/A