Un dispositivo microfluidico per l'imaging in tempo reale e il monitoraggio della pressione durante la formazione del biofilm

Abstract

Fonte: Kurz, D. L., et al. Piattaforma microfluidica per studiare il bioclogging in mezzi porosi. J. Vis. Esp. (2022)

Il video dimostra l'uso di un dispositivo microfluidico per studiare la formazione del biofilm. Viene introdotta una sospensione batterica nel microcanale, seguita da un'incubazione per permettere lo sviluppo del biofilm. Il flusso viene quindi ripreso e il monitoraggio della pressione insieme all'imaging viene utilizzato per rilevare la formazione di biofilm e l'ostruzione dei pori nel tempo.

Protocollo

1. Preparazione del wafer al silicio

1. Progetta le geometrie del canale microfluidico in software di progettazione assistita da computer (CAD; vedi Tabella dei materiali) e stampala su una pellicola trasparente per creare la fotomaschera (Figura 1A).
2. Fabbrica lo stampo master tramite litografia morbida (in condizioni di sala pulita) seguendo i passaggi seguenti.
   1. Cuocere la wafer di silicio a 200 °C per 2 ore.
   2. Posizionare la wafer al centro di un spin-coater e versare la fotoresistenza SU8 3050 (vedi Tabella dei Materiali) sulla wafer. Spin coat a 1.700 giri/min per 40 secondi con un tempo di rampa di 10 s/100 giri/min.
      NOTA: I parametri di spin-coating sono stati impostati per ottenere uno spessore target di 100 μm per l'SU8 3050.
   3. Dopo il processo di spin-coating, cuocere dolcemente la wafer di silicio a 65 °C per 600 s e 95 °C per 2.700 s. Lascia raffreddare la wafer a temperatura ambiente durante la notte.
      NOTA: Il raffreddamento notturno migliora l'adesione del SU8 al wafer.
   4. Posizionare la fotomaschera (passo 1.1) sulla wafer ed esporla alla luce UV, con un'energia di esposizione di 250 mJ/cm² e una lunghezza d'onda di 350 nm.
   5. Dopo l'esposizione, cuocere il substrato esposto a 65 °C per 60 secondi e 95 °C per 300 secondi.
   6. Sviluppare la wafer di silicio per ottenere lo stampo master immergendolo in un becher riempito con il rivelatore mrDev600 (vedi Tabella dei Materiali). Scuoti delicatamente il becher per 1.800 secondi per lavare via la resistenza non polimerizzata. Poi, lava con spray spray di isopropanolo sul wafer di silicio e asciuga all'aria.
   7. Cotto duramente la wafer di silicio a 200 °C per 1.800 secondi.
3. Silanizzare lo stampo master tramite deposizione a vapore di 20 μL di silano Trichloro (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyl) (vedi Tabella dei Materiali) posizionato su un vetrino di vetro accanto allo stampo per 40 minuti in un essiccatore a vuoto, creando una pressione manometrica di 100 mbar.

2. Fabbricazione del dispositivo microfluidico

NOTA: La procedura di fabbricazione descritta qui è per un dispositivo microfluidico con un canale microfluidico. Tuttavia, lo stesso metodo può essere applicato per fabbricare un dispositivo microfluidico con più canali microfluidici in parallelo.

1. Mescola l'elastomero con il suo reticolatore in un rapporto di 10:1 (vedi Tabella dei Materiali) per preparare una miscela di polidimetilsossiano (PDMS). Mescola la miscela finché non si mescola uniformemente e diventa opaca a causa delle bolle d'aria chiuse.
2. Si degasa la miscela in un essiccatore a vuoto, creando una pressione manometrica di 100 mbar finché le bolle d'aria intrappolate non vengono rimosse e il risultato risulta trasparente. Il tempo necessario per la degassazione è tipicamente di 30 minuti.
3. Posiziona lo stampo master (passo 1) in un piatto per coltura cellulare (vedi Tabella dei Materiali). Versare 20 g della miscela PDMS sullo stampo master per ottenere canali con uno spessore finale di 5 mm.
4. Cuocere lo stampo maestro a 70 °C per 2 ore.
5. Taglia il PDMS polimerizzato intorno al canale microfluidico (a una distanza di circa 3 mm) usando una lama, poi stacca il canale microfluidico PDMS dallo stampo master.
6. Per creare l'ingresso e l'uscita dei canali microfluidici, si forano con un perforatore per biopsia (diametro di 1,5 mm) alle estremità (parte superiore dei triangoli, vedi Figura 1A). Fai un foro aggiuntivo al centro del triangolo di ingresso per installare il sensore di pressione in seguito.
7. Lava un vetrino di vetro e il canale microfluidico con una soluzione detergente all'1% disponibile in commercio (vedi Tabella dei materiali) per 5 minuti, poi risciacquali con acqua deionizzata. Successivamente, lava il canale microfluidico del PDMS e il vetrino del vetro con isopropanolo. Poi, risciacquali di nuovo con acqua deionizzata. Asciuga il canale microfluidico PDMS e il vetrino di vetro con aria compressa a 1 bar per 1 minuto.
   NOTA: La struttura porosa del PDMS deve essere completamente asciutta affinché il legame sia efficace.
8. Posizionare il vetrino di vetro e il canale microfluidico in un detergente al plasma (vedi Tabella dei Materiali) e assicurarsi che le superfici da incollare siano rivolte verso l'alto. Accendi il detergente al plasma e tratta il canale microfluidico e il vetrino di vetro con plasma d'aria a un flusso d'aria di 1 SL/h (litro standard all'ora) per 1 minuto. Attacca il canale microfluidico al vetrino del vetro subito dopo averli estratti dal detergente, mettendoli a contatto tra loro.
   NOTA: Assicurati di non toccare le superfici trattate, perché questo potrebbe influire sul legame. Quando si fabbrica un dispositivo microfluidico con più canali microfluidici, esponi i canali microfluidici contemporaneamente e li leghi in un unico passaggio.
9. Posiziona il dispositivo microfluidico legato su una piastra riscaldante a 80 °C per almeno 15 minuti.
10. Conserva il dispositivo microfluidico in un piatto pulito per colture cellulari fino all'inizio dell'esperimento.

3. Preparazione della sospensione batterica

1. Coltivare una popolazione di Bacillus subtilis NCIB 3610 per 20 ore prima dell'inizio dell'esperimento inoculando direttamente 3 mL di mezzo di coltura per brodo nutritivo n. 3 (vedi Tabella dei materiali) da una scorta di glicerolo congelata in un tubo di coltura da 15 mL. Incubare in un incubatore a 30 °C e 200 giri al minuto durante la notte (per 16 ore).
2. Realizzare una sottocultura dalla coltura notturna 4 ore prima dell'inizio dell'esperimento aggiungendo 3 μL della coltura notturna in 3 mL di mezzo fresco (diluizione 1:1.000) in un tubo da 15 mL. Incubare la sottocultura in un incubatore a scuotimento a 30 °C a 200 giri/min per 3,5-4 ore per ottenere una densità ottica a 600 nm (OD₆₀₀) di 0,1.

4. Esperimento di crescita del biofilm

1. Accendi l'incubatore a scatola del microscopio 3 ore prima dell'esperimento per garantire una temperatura stabile di 25 °C. Monta la pompa della siringa e i sensori di pressione (vedi Tabella dei materiali).
2. Collega il tubo di entrata e uscita al dispositivo microfluidico. Inserire direttamente un ago (con un diametro esterno di 0,6 mm) nel tubo di ingresso per assicurare la connessione tra il tubo e la siringa.
3. Mettere il dispositivo microfluidico, 30 mL di acqua deionizzata e 30 mL di mezzo colturale in un essiccatore a vuoto e degassare per almeno 1 ora. Poi, tira lentamente il mezzo di coltura e l'acqua deionizzata in due siringhe separate da 30 mL.
   NOTA: Questo passaggio è fondamentale per prevenire la formazione di bolle nel canale durante il lavaggio con il mezzo di coltura.
4. Monta il dispositivo microfluidico sul microscopio e posiziona il tubo di uscita in un contenitore di rifiuti.
   1. Collega la siringa piena di acqua deionizzata al canale microfluidico attraverso il tubo microfluidico e inietta lentamente l'acqua fino a esce dall'uscita del sensore di pressione. Riempi il sensore di pressione con acqua e risciacqua tutte le bolle dal tubo che collega il canale microfluidico al sensore di pressione. Chiudi l'uscita del sensore di pressione con le viti dedicate al sensore di pressione.
      NOTA: La procedura di riempimento descritta garantisce che le variazioni di pressione all'ingresso dei canali microfluidici vengano registrate con precisione. Quando si esegue un esperimento con più canali microfluidici, collega ogni canale a una siringa separata per garantire condizioni di flusso uguali in tutti i canali.
5. Riempi il resto del canale microfluidico con l'acqua deionizzata.
6. Inserire un filtro da 1,2 μm (vedi Tabella dei Materiali) sulla siringa del mezzo di coltura. Poi, rimuovi la siringa ad acqua e collega con cura la siringa del mezzo di coltura al tubo microfluidico in ingresso. Montare la siringa sulla pompa e risciacquare il canale con il mezzo di coltura a una portata di 2 mL/h per 1 ora.
   NOTA: Il filtro impedisce alle cellule batteriche di entrare nella siringa durante il carico. Lavare il canale microfluidico con il mezzo di coltura rimuoverà le bolle residue nella struttura porosa.
7. Durante l'esperimento imposta la pompa della siringa alla portata desiderata (qui 1 mL/h) e imposta la lettura di pressione dei sensori a zero.
   NOTA: Impostando la lettura iniziale della pressione a zero, verrà misurata solo la differenza di pressione causata dallo sviluppo del biofilm durante l'esperimento.
8. Pipetta 1 mL della coltura batterica a un OD₆₀₀ di 0,1 in una fiala centrifuga da 1,5 mL. Carica la coltura batterica nel canale microfluidico posizionando il tubo di uscita nella fiala della centrifuga. Dopo aver atteso 5 minuti per rimuovere eventuali bolle d'aria dall'uscita dei tubi, preleva 150 μL di soluzione batterica a una portata di 1 mL/h, finché il canale microfluidico non viene riempito con la coltura batterica.
9. Rimuovi con cura il filtro della siringa per il mezzo di coltura e inserisci l'uscita nel contenitore dei rifiuti. Lasciare le cellule batteriche in condizioni di flusso zero nel canale microfluidico per 3 ore per permettere il loro attacco superficiale nel mezzo poroso.
   NOTA: Lasciare le cellule batteriche in condizioni di flusso zero per 3 ore è stato ottimizzato per l'attacco del ceppo batterico utilizzato, assicurando al contempo una coltura batterica ben ossigenata. Altri ceppi batterici potrebbero richiedere più o meno tempo.
10. Per iniziare l'esperimento, avvia il flusso impostando la pompa della siringa al flusso desiderato (qui 1 mL/h) e inizia la lettura della pressione a 1 Hz.
11. Acquisire immagini del biofilm in crescita all'intervallo di tempo desiderato, configurazione ottica e ingrandimento. ​
    NOTA: Nel presente studio, sono state acquisite immagini a ingrandimento 4x in modalità campo chiaro in 18 posizioni che coprono l'intero dominio del mezzo poroso ogni 6 minuti per 24 ore.

Risultati

Figura 1: Progettazione di canali microfluidici e configurazione sperimentale. (A) Fotomaschera dei canali microfluidici con diverse dimensioni dei pori (75 μm, 150 μm e 300 μm) utilizzata come analoghi dei mezzi porosi e ...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Filtro a siringa Acrodisc 25 mm, membrana Versapor 1,2 μm	Pall Corporation	PN4190	Filtri da 1,2 μm
Siringa BD da 10 mL (Luer-Lock)	BD	300912	Usato per riempire il canale con acqua deionizzata
Incubatore a scatola	Servizi di Imaging Vitale		Un tempo manteneva una temperatura stabile durante l'esperimento di crescita del biofilm
Misuratore di densità cellulare CO8000	Bioonde WPA		Misuratore OD
Fiala centrifuga	Eppendorf	30120086	1,5 mL
CETONI Base 120	CETONI GmbH		Pompa per siringa
CorelCAD	CorelDRAW		software utilizzato per progettare le geometrie dei canali microfluidici
Tubi di coltura (14 mL, sterili)	Greiner Bio-One		Tubi di coltura
Forno per asciugare, VENTI-Line	VWR		Forno per curare il PDMS
Comodo	Migros		Soluzione detergente
Piastra riscaldante con controllo della temperatura	VRW		per curare il legame PDMS-vetro dopo il trattamento al plasma
Innova 42 Inc Shaker (New Brunswick)	Eppendorf		Incubatore
Isopropanolo (> 99,8%)	Sigma Aldrich	67-63-0
Tubo di trasferimento Masterflex	Masterflex	HV-06419-05	0,020'' diametro diametrale, 0,06'' diametro diametrale
Micro Slides, Semplici, 75 x 60 mm	Corning	2947-75X50	Vetri in vetro
Sensore di pressione microfluidico (1 bar)	Flusso di Elfi		Sensori di pressione
Punzatore per biopsia Miltex, diametro 1,5 mm	Integra		Perforatore per creare i fori di ingresso e uscita del canale microfluidico
sviluppatore mrDev600	Microresist
Nikon Eclipse Ti2	Strumenti Nikon		Microscopio
Brodo nutritivo n°3	Sigma Aldrich
Siringa Omnifix con Luer-Lock	B.Braun		Siringhe di diversi volumi
Camera al plasma Zepto	Diener Electronic	ZEPTO-1	usata per legare al plasma il PDMS e il vetrino di vetro
Pulizie di precisione (Kimtech Science)	Kimberly Clark	KCP-7552	per asciugare il vetrato del vetro
Scala	VWR-CH	611-2605	Utilizzato per pesare il rapporto tra elastomi e agenti di reticolazione
Rimossa in silicio (10 cm)	Silicon Materials Inc.		N//Phos <100> 1-10 Ω cm
Spincoater, modulo spin SM150	Sawatec
SU8 3050 Fotoresist	Kayakuam
Allineatore per maschere Süss MA6	Gruppo SUSS MicroTec		Usata per allineare la maschera cromato-vetro
Sylgard 184	Dow Corning		kit elastomero in silicone; agente di polimerizzazione
Techni Etch Cr01	Technic		Technic
Piatto per coltura tissutale 150	TPP	93150
Tricloro-silano (1H, 1H, 2H, 2H perfluorooctyl) silane	Sigma Aldrich	Sigma Aldrich	Usata per silanizzare la wafer di silicano
Veeco Dektak 6 M	Veeco		Profilometro