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1. Inoculazione dei batteri
- Determinare il numero di batteri da inoculare con riferimento alla misura da utilizzare per determinare l'adesione batterica e la durata del tempo di incubazione.
- Per studi microscopici che prevedono tempi di incubazione inferiori a 1 giorno, inoculare un numero relativamente elevato di batteri. Aggiungi una quantità di coltura per raggiungere una concentrazione batterica finale superiore a10-6 batteri per mL. Per tempi di incubazione più lunghi, si riducono le dimensioni dell'inoculo batterico.
- Per studi in cui l'adesione batterica sarà misurata tramite conteggi cellulari vitali, si aggiunge una quantità di coltura per raggiungere una concentrazione batterica finale di 10-3-10,6 batteri per mL.
- Evita di aggiungere così tanti batteri che il loro metabolismo modifichi il pH o la concentrazione di ossigeno nel mezzo di incubazione. Misura il pH usando carta per pH o un elettrodo. Misura la concentrazione di ossigeno usando un elettrodo di ossigeno.
- Per le piante coltivate nella sabbia, vaccina in tre modi possibili.
- Inocula i semi con i batteri prima di piantarli, lasciandoli in ammollo per 1 minuto in una sospensione in acqua di circa10-6 batteri per mL.
- Inocula la radice germinando le piantine axeniche. Quando la radice della piantina è lunga circa 1 cm, immergila o metti l'intera piantina in una sospensione di 106 batteri per mL in acqua per 1 minuto.
- Inocula la sabbia mescolando i batteri con la sabbia prima della piantagione per ottenere una concentrazione finale di circa 103 batteri per mL oppure annaffiando la piantina con una sospensione di 106 batteri per mL dopo la piantagione.
2. Incubazione dei batteri con il materiale vegetale
- Per l'incubazione in mezzo liquido, incubare i batteri con il materiale vegetale in acqua sterile o saccarosio e sali minerali o mezzo di coltura vegetale (ad esempio una diluizione 1:10 della miscela di sale basale Murashige e Skoog o sali MS).
- Usa un contenitore a cui i batteri non si attaccano. Cerca di mantenere la superficie della pianta coperta in modo continuo, sia con immersione che con una lieve agitazione. Un'agitazione vigorosa può impedire l'adesione o addirittura rimuovere batteri dalla superficie della pianta.
- Osserva il materiale vegetale al microscopio luminoso dopo intervalli di tempo variabili per determinare quando fermare l'incubazione e effettuare misurazioni. Un percorso temporale di adesione è spesso prezioso, con campioni prelevati ogni 1-4 ore o ogni giorno, a seconda della velocità dell'interazione.
- Per incubare nella sabbia, applicare le stesse considerazioni descritte per l'incubazione in mezzo liquido nel passo 2.1.
3. Misurazione dell'adesione tramite microscopia
- Effettuare misurazioni microscopiche con Nomarski o ottica a contrasto di fase per una facile visuale dei batteri sulle superfici. Tuttavia, può essere utilizzato qualsiasi microscopio da campo chiaro con ingrandimento di 20X o superiore.
- Utilizza l'osservazione microscopica per determinare se i batteri sono distribuiti casualmente o si trovano in siti specifici. Controlla anche se sono legati singolarmente o in gruppi. Cerca la presenza di microcolonie che suggeriscano crescita batterica o intrappolamento dopo l'adesione. Controlla se i batteri sembrano formare un biofilm sulla superficie.
NOTA: Un biofilm è un gran numero di batteri legati alla superficie e circondati da una matrice extracellulare. La struttura può essere liscia e uniforme oppure avere un'architettura più complicata. - Usa batteri contrassegnati con un marcatore fluorescente. Se sono presenti altri batteri e i batteri di interesse sono identificati da un tag fluorescente come la proteina fluorescente verde (GFP), si utilizza la microscopia a fluorescenza per determinare la presenza dei batteri marcati in gruppi di altri batteri. Per la GFP, si utilizza un filtro con eccitazione di 490 nm ed emissione di 520 nm.
- Verifica che il tag fluorescente non stia influenzando negativamente i batteri osservando l'adesione al materiale axenico di una miscela uguale di batteri di tipo selvatico e batteri marcati dello stesso ceppo, utilizzando sia l'ottica di Nomarski che quella a fluorescenza. Se i batteri fluorescenti e scuri sono mescolati casualmente e presenti in numero uguale, allora il tag non interferisce con il saggio.
- Determina il numero di batteri attaccati.
NOTA: È molto difficile determinare il numero di batteri attaccati al microscopio. Quando il legame avviene su superfici vegetali irregolari, generalmente non è possibile ottenere una misurazione quantitativa. La microscopia elettronica a scansione (non discussa in questo articolo) può essere utilizzata per effettuare tali misurazioni.- Quando i batteri sono legati a una superficie liscia, come un pelo radicale, si conta il numero di batteri legati al bordo del pelo radicale per millimetro di lunghezza del pelo radicale. Fai attenzione a utilizzare peli radicali di dimensioni e forma più o meno uguali nel confronto delle misure.
- Per determinare la dimensione degli oggetti al microscopio, si utilizza un vetrino commerciale con marcature misurate. Osserva e fotografa questa diapositiva alle stesse impostazioni usate per il materiale sperimentale e usa le immagini risultanti per determinare la dimensione degli oggetti nelle fotomicrografie.
- Prepara il campione per la microscopia.
- Lava il campione. Sposta il campione su una goccia d'acqua o un mezzo di incubazione su un vetrino per microscopio e osservalo direttamente.
NOTA: Questo ha il vantaggio che, se non ci fosse stata crescita batterica o morte batterica effettiva, è improbabile che ci siano molti batteri liberi. Prendi l'assenza di batteri liberi come un segnale d'allarme che potrebbe esserci stata una morte batterica o un legame batterico al contenitore in cui è stata effettuata l'incubazione. L'effetto del lavaggio del campione è mostrato nella Figura 1. - Lava delicatamente il campione in acqua o in mezzo di incubazione mettendolo in una fiala di liquido e invertendo delicatamente la fiala. Poi posiziona il campione sul vetrino del microscopio in liquido fresco per l'osservazione.
- Montare il campione in liquido utilizzando un normale slip di copertura e un vetrino per microscopio.
- Se il campione è spesso e quindi creerebbe un rigonfiamento sotto il slip di copertura, usa un slip di copertura a press-applica. Questi sottili di copertura hanno un anello di gomma o plastica attorno al bordo del svestimento di copertura. Metti il liquido e il campione nel pozzo nel giappo di copertura, poi posiziona il vetrino sopra e premi delicatamente per sigillare il voglio di copertura sul veglietto. Inverti ed esamina.
- In alternativa, usa un vetrino per il conteggio delle alghe e un slip di copertura in modo simile. Si noti che le vetrine con questa profondità generalmente non possono essere esaminate con una lente obiettivo di ingrandimento superiore a 20X.
