Formazione dei granuli da stress durante l'infezione da Shigella delle cellule epiteliali cancerose

Abstract

Fonte: Vonaesch, P. et. al., Analisi immunofluorescenza della formazione di granuli da stress dopo sfida batterica nelle cellule di mammiferi. J. Vis. Esp. (2017)

Questo video mostra l'infezione delle cellule epiteliali con il batterio patogeno Shigella flexneri e la conseguente risposta cellulare dell'ospite. Le proteine fettrici batteriche interrompono la traduzione dell'ospite, innescando la formazione di organelli privi di membrana chiamati granuli di stress, che riflettono la risposta adattativa della cellula all'infezione.

Protocollo

1. Preparazione di batteri e cellule ospiti

1. Trasferire slitti di copertura in vetro da 12 o 14 mm in piastre da 24 o 12 pozzi, rispettivamente, con pinzette sterili, contando un pozzo per ogni condizione sperimentale. Sterilizzali con trattamento ultravioletto (UV) in un cappuccio per coltura tissutale per 15 minuti.
   NOTA: Includere pozzi di controllo per la sfida batterica e per l'induzione da granuli di stress (SG) da stress esogeni.
2. Per una piastra a 24 pozzi con coperture da 12 mm, seminare 1 x 10⁵ cellule di mammifero (ad esempio, cellule HeLa) su spiastre di copertura; Premi le copertine con una punta sterile di pipetta. Lascia che le cellule si attaccano durante la notte a 37 °C in un incubatore di coltura al 5%_CO-2 in un mezzo di coltura adatto a ciascun tipo cellulare.
   NOTA: Cellule a placca in modo che la confluenza delle cellule sia tra il 40 e il 60% il giorno successivo.
   1. Per le cellule HeLa, incubare nel mezzo Eagle modificato (DMEM) di Dulbecco con amminoacidi non essenziali (NEAA) e siero fetale per vitelli (FCS) decomplementato al 10%. Sminui la FCS riscaldando per 30 minuti in un bagno d'acqua a 56 °C, facendo roteare il siero una volta dopo 15 minuti.
3. Per eliminare i batteri, usa una punta sterile per una pipetta per rimuovere una piccola quantità da un deposito di glicerolo batterico (20% glicerolo) conservato in un congelatore a -80 °C e posizionalo su un piatto etichettato. Usa un anello sterile per distribuire i batteri su circa il 10% della piastra di piastra (SING). Usa un nuovo anello sterile e trascinalo attraverso la sfumatura per creare 3 linee parallele, lunghe mezza placca. Scivola attraverso queste linee, coprendo il resto della placca. Incubare la piastra O/N a 37 °C.
   1. Seleziona una singola colonia batterica (ad esempio, Shigella flexneri) dalla piastra appena striata. Evita di lavorare con colonie batteriche più vecchie di una settimana.
   2. Per il ceppo M90T di S. flexneri , inoculare una colonia rossa da una lastra di agar triptico di soia appena striata in una piastra di agar rosso Congo allo 0,1% in 8 mL di brodo di soia triptica in un tubo da 15 mL; Stringere il coperchio e incubare scuotendo a 222 giri/min O/N a 30 °C. ATTENZIONE: Non usare grandi colonie bianche perché hanno perso il plasmide di virulenza e non sono infettive.

2. Sfida batterica delle cellule ospiti

1. Prepara i batteri per massimizzare il potenziale di infezione.
   1. Per S. flexneri, subcoltura i batteri aggiungendo 150 μL di coltura O/N a 8 mL di agar di soia triptico e incuba le scuotere a 222 giri/min a 37 °C fino alla fase esponenziale tardiva (~2 h) per indurre l'espressione genica della virulenza e aumentare l'infezione.
      1. Quando la coltura ha una densità ottica compresa tra 0,6 e 0,9 (misurata a 600 nm), trasferire 1 mL di coltura in un tubo da 1,5 mL. Batteri pellet per 2 minuti a 8.000 x g e risospendere nel mezzo infettivo (DMEM con NEAA, privo di FCS) a OD₆₀₀ = 1. Quindi, se il diametro₆₀₀ è 0,85, si risospenda a 850 μL.
         NOTA: Per S. flexneri, a OD₆₀₀ = 1, ci saranno 8 x 10⁸ batteri per mL quando coltivati in un mezzo da 8 mL. Una molteplicità di infezioni (MOI) di 20 è appropriata. Per altri patogeni, il numero di batteri per mL a un OD₆₀₀ e il MOI appropriato devono essere determinati empiricamente.
   2. Per migliorare le interazioni batteri-ospite, rivestire i batteri con poli-L-lisina (PLL).
      NOTA: Il trattamento con PLL di S. flexneri non ha avuto alcun effetto sulla dinamica della SG. Altri patogeni devono essere valutati per la loro idoneità al trattamento PLA.
      1. Per rivestire i batteri con PLL, centrifugare 1 mL di coltura batterica per 2 minuti a 8.000 x g, poi risospendere il pellet in 10 μg/mL di PLL in soluzione salina tamponata fosfato (PBS) a un diametro_{diametrale di 600} = 1.
      2. Aggiungi la soluzione batterica in un piccolo piatto, come un pozzo all'interno di una piastra a 12 pozzi, e incuba a RT (~ 20 °C) per 10 minuti con una delicata agitazione su un mixer per piatti.
      3. Dai batteri a pellet per 2 minuti a 8.000 x g, rimuovi l'eccesso di PLL. Risospezione del pellet in 1 mL PBS e ripeti questo passaggio due volte. Dopo il lavaggio finale, risospese nel mezzo infettivo a OD₆₀₀ = 1.
         NOTA: Qui, il mezzo di infezione per S. flexneri è il mezzo cellulare ospite con 20 mM di N-(2-Idrossietil)piperazina-N'-(2-acido etanosulfonico) (HEPES) senza FCS.
2. Prepara le cellule alla sfida batterica.
   1. Rimuovere il substrato dalle cellule HeLa dei mammiferi usando una pompa di aspirazione. Aggiungere 500 μL di mezzo cellulare HeLa RT per lavare le cellule, far ruotare, rimuovere il mezzo utilizzando una pompa di aspirazione e sostituire con un mezzo di infezione adatto a temperatura ambiente (RT) da 500 μL (ad esempio, mezzo cellulare ospite con 20 mM HEPES senza FCS).
   2. NOTA: Per tutte le fasi di lavaggio, lavora rapidamente e lavora solo fino a 4 copertine alla volta per evitare che le celle si secchino.
3. Challenge preparò le cellule HeLa con batteri per infettare il 20-50% delle cellule.
   NOTA: È necessario determinare il momento e il MOI appropriati per ogni specie batterica. In generale, un buon inizio è di 30 minuti a 37 °C con un MOI di 10.
   1. Per S. flexneri, sfidare le cellule HeLa usando uno dei due metodi (passo 2.3.1.1 o 2.3.1.2).
      1. Spingere batteri non trattati con PLL (20 μL di OD₆₀₀ = 1/pozzo di piastra a 24 pozzi in mezzo da 500 μL) sulle cellule per 10 minuti a 13000 x g.
      2. Aggiungere batteri rivestiti di PLL (15 μL di OD₆₀₀ = 1/pozzo di piastra a 24 pozzetti in un mezzo da 500 μL) per 15 minuti a RT per permettere ai batteri di depositarsi sulle cellule.
   2. Lascia che l'infezione si verifichi inserendo cellule con batteri sedimentati in un incubatore di coltura a 37 °C per 30 minuti.
      NOTA: Per i momenti brevi, sincronizza l'infezione da S. flexneri posizionando le piastre in un bagno d'acqua a 37 °C per 15 minuti invece che nell'incubatore di coltura tissutale.
4. Fermare l'infezione lavando le cellule.
   1. Per lavare le cellule e rimuovere i batteri in eccesso, rimuovere il mezzo utilizzando una pompa di aspirazione, aggiungere 1 mL di mezzo di coltura HeLa fresco preriscaldato (37 °C) (DMEM, 10% FCS, NEAA). Mescolate il substrato, toglietelo e sostituiscilo con un substrato nuovo. Ripeti due volte e lascia il mezzo fresco sulle cellule.
      1. Per S. flexneri o altri batteri intracellulari, dopo l'infezione delle cellule HeLa e dei lavaggi, si sostituisce il mezzo con un substrato standard di coltura tessutale contenente 50 μg/mL di gentamicina per uccidere i batteri extracellulari e prevenire ulteriori invasioni cellulari.
         NOTA: Non aggiungere antibiotici al mezzo per i batteri extracellulari.
5. Incubare i batteri con le cellule per il tempo desiderato in un incubatore di colture tissutali.
   NOTA: Per S. flexneri, l'infezione può durare fino a 6 ore, a seconda del tipo cellulare. Per le cellule HeLa, lascia che l'infezione provini per 1,5 - 2 ore prima di aggiungere stress esogeni per indurre la formazione di SG. Per le infezioni da Caco-2, in cui Shigella si diffonde da cellula a cellula, si infecciona per 30 minuti a 6 ore prima di aggiungere stress esogeno. Le cellule possono essere fissate a questo punto senza aggiungere stress esogeni per valutare la formazione delle SG a seguito dell'infezione batterica.

3. Fissazione e analisi immunofluorescenza della formazione dei granuli da stress

NOTA: Processare contemporaneamente le coperture di controllo e quelle sperimentali per evitare differenze di colorazione che potrebbero influire sull'analisi delle immagini nelle fasi successive. I campioni di controllo includono l'assenza di infezione con e senza trattamento inducente SG, e campioni infetti con e senza trattamento inducente SG.

1. Rimuovere completamente il mezzo utilizzando una pompa di aspirazione e fissare i campioni aggiungendo 0,5 mL di paraformaldeide (PFA) al 4% di RT nel PBS. Incubare per 30 minuti in tempo di ritiro.
   ATTENZIONE: La PFA è dannosa per chi la maneggia e per l'ambiente. Adottare le misure appropriate per proteggere chi manipola e smaltire i rifiuti chimici.
   NOTA: In alternativa, fissare per 15 minuti e poi sostituire con metanolo preraffreddato a -20 °C per 10 minuti per mantenere una maggiore localizzazione citoplasmatica dei marcatori SG.
2. Rimuovere il PFA con una pipetta e gettare il liquido in un contenitore di rifiuti appropriato. Lavare il coperto con 1 mL di soluzione fisiologica tris-tamponata (TBS: 25 mM Tris, pH 7,3; 15 mM cloruro di sodio, NaCl). Incuba il sottocoperta per 2 minuti scuotendolo dolcemente su uno shaker per piatti durante il lavaggio.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Shigella flexneri			Disponibile su vari laboratori su richiesta
Brodo di soia a caseina triptone (TCS)	BD in Biologia	211825	Mezzo di crescita standard per Shigella, applicazione - crescita batterica
AGAR TCS	BD in Biologia	236950	Agar di crescita standard per Shigella, applicazione - crescita batterica
Rosso Congo	SERVA Electrophoresis GmbH	27215.01	Strumento di discriminazione per Shigella che ha perso il plasmide di virulenza, applicazione - crescita batterica
Poli-L-Lisina (PLL)	Sigma-Aldrich	P1274	Utile per rivestire i batteri e aumentare l'infezione, applicazione - infezione
Gentamicina	Sigma-Aldrich	G1397	Uccisione selettiva di batteri extracellulari ma non citosolici, applicazione - infezione
HEPES	Life Technologies	15630-056	Il buffer di pH è utile quando le cellule vengono incubate in RT, applicazione - coltura cellulare
Eagle medium modificato (DMEM) di Dulbecco	Life Technologies	31885	Mezzo di coltura standard per cellule HeLa, applicazione - coltura cellulare
Siero fetale per vitelli (FCS)	Biowest	S1810-100	Integrazione al 5% utilizzata per il mezzo di coltura cellulare HeLa, applicazione - coltura cellulare
Amminoacidi non essenziali (NEAA)	Life Technologies	11140	Diluizione 1:100 utilizzata per il mezzo di coltura cellulare HeLa, applicazione - coltura cellulare
Dimetilsolossido (DMSO)	Sigma-Aldrich	D2650	Diluente del reagente, applicazione - coltura cellulare
Paraformaldeide (PFA)	Scene di microscopia elettronica	15714	Il 4% di PFA viene utilizzato per la fissazione standard delle cellule, applicazione - fissazione
Placca di coltura cellulare a 24 pozzi	Sigma-Aldrich	CLS3527	Placche standard di coltura tissutale, applicazione - coltura cellulare
Coperture in vetro da 12 mm	NeuVitro	1001/12	Supporto alla coltura cellulare per applicazioni immunofluorescenti, applicazione - supporto cellulare
Pinza	Sigma-Aldrich	81381	Mezzo di montaggio economico e robusto che funziona bene per la maggior parte dei fluorofori, applicazione - montaggio