Imaging a fluorescenza della colonizzazione batterica nel tessuto renale del topo

Abstract

Fonte: Behera, R. K., et al. Un metodo basato sulla fluorescenza per studiare la regolazione genica batterica nei tessuti infetti. J. Vis. Esp. (2019)

Questo video mostra un metodo per preparare il tessuto renale infetto del topo, colorare il DNA e rilevare l'espressione genica batterica utilizzando doppi reporter fluorescenti. Il rosso segna tutti i batteri, mentre il verde mette in evidenza le cellule sensibili all'infezione.

Protocollo

Tutte le procedure che coinvolgono campioni animali sono state esaminate e approvate dal comitato di revisione etica degli animali competente.

1. Prelievo degli organi e elaborazione dei tessuti
   1. Eutanasiare gli animali tramite inalazione di CO₂ e lussazione cervicale come metodo secondario, e eseguire una necropsia.
   2. Preleva il rene (a destra) e altri organi vitali (cuore, fegato, polmoni, milza) e trasferisci in tubi di polipropilene da 15 mL contenenti formalina tamponata al 10% [v/v].
   3. Lascia che gli organi si fissino al buio a temperatura ambiente con lievi scuotiti o rotazioni per almeno 24 ore, ma non più di 48 ore.
   4. Inserire gli organi in un mezzo trasparente per il congelamento dei tessuti e conservare i tessuti a -80 °C.
   5. Utilizzando un criostato, sezionare il tessuto in fette di spessore 10 μm.
   6. Asciuga le sezioni su un vetrino di vetro pre-pulito e caricato per 20 minuti al buio. Applica un mezzo di montaggio rigido con una tinta 4',6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI) e un coperto. Le vetri vengono montate a temperatura ambiente durante la notte e trasferite a 4 °C per la conservazione a lungo termine.
2. Microscopia confocale a scansione laser ed elaborazione delle immagini
   1. Esaminare i vetrini montati per individuare lesioni utilizzando laser adatti al segnalatore fluorescente utilizzato. In questo caso, vengono utilizzati i segnali di fluorescenza verde (GFP o proteina fluorescente verde), rosso (tdTomato) e blu (DAPI).
   2. Acquisire l'immagine utilizzando l'obiettivo appropriato per visualizzare le singole celle (ad esempio, tipicamente si usano obiettivi 20x o 40x).

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
C57Bl/6 mouse	Fiume Charles	NA
Microscopio laser confocale a scansione	Zeiss	NA
Microtomo criostatico	Thermo Scientific	NA
Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)	Cellgrow	46-013-CM
Omogeneizzatore Precellys 24	Laboratori Bertin	NA
Mezzo congelante trasparente Sub Xero	Mercedes Medical	MER5000
Vetri Superfrost Plus	Fisher Scientific	12-550-15
Vectashield Medium di montaggio antifade con DAPI	Laboratori Vector	H-1500