Imaging dei cambiamenti morfologici nei batteri utilizzando la microscopia a fluorescenza a cellule vive

Abstract

Fonte: Brzozowski, R. S. et al. Microscopia a fluorescenza a cellule vive per indagare la localizzazione delle proteine subcellulari e i cambiamenti morfologici cellulari nei batteri. J. Vis. Esp. (2019)

Questo video dimostra la microscopia a fluorescenza a cellule vive per visualizzare cambiamenti morfologici in tempo reale nei batteri. Descrive i passaggi coinvolti nell'imaging, nell'acquisizione del time-lapse e nella deconvoluzione per ottenere immagini ad alta risoluzione in tempo reale.

Protocollo

1. Imaging

1. Il giorno dell'esperimento, accendi il sistema di microscopio. Avvia il software di imaging (vedi Tabella dei Materiali) cliccando sull'icona appropriata sul desktop. Inizializza il microscopio cliccando sull'opzione Inizializza microscopio (pulsante raffigurato con un microscopio) nella finestra di avvio del software. Assicurarsi che l'obiettivo sia completamente abbassato utilizzando la regolazione grossolana del microscopio prima dell'inizializzazione.
   NOTA: Dopo l'inizializzazione, dovrebbero apparire tre finestre di dialogo aggiuntive oltre al menu start: resolve3D, raccolta dati e monitoraggio del filtro.
2. Inserire una goccia di olio di 1,517 (indice di rifrazione) sull'obiettivo di immersione in olio 100x fornito dal produttore (Apertura numerica = 1,4, Distanza di lavoro = 0,12 mm; vedi Tabella dei Materiali).
   NOTA: È importante scegliere l'olio a immersione appropriato per la temperatura a cui vengono effettuate le immagini.
3. Carica la piastra di vetro che contiene il campione nella custodia metallica (bara) e scivolala delicatamente nella pinza del palco.
4. Usa la manopola di regolazione grossolana per sollevare l'obiettivo finché l'olio non tocca il fondo del vetro del piatto. Usa l'oculare e la manopola di regolazione fine per mettere a fuoco il campione. Una volta che le celle sono a fuoco, gira la manopola dall'oculare alla modalità fotocamera spostando l'interruttore selettore situato sulla parte anteriore del corpo del microscopio verso sinistra.
5. Inizia l'esperimento usando il software di imaging. Nella finestra di resolve3D , seleziona l'icona Design/run experiment raffigurata da una fiaschetta. Dovrebbe apparire una nuova finestra di dialogo intitolata progetta/esperimento.
   1. Imposta il numero di Z-stack e lo spessore del campione usando la scheda design e poi sezione nella finestra di dialogo progettazione/esecuzione dell'esperimento .
      NOTA: Per gli esperimenti nella sezione dei risultati rappresentativi, sono stati utilizzati 17 Z-stack a intervalli di 200 nm per immagini statiche e quattro Z-stack a intervalli di 200 nm per la microscopia time-lapse.
   2. Per misurare lo spessore delle celle nel campione, regolare manualmente il piano Z in modo incrementale usando le frecce su e giù nella finestra di dialogo resolve3D . Segna dove le celle si sfocano come limite superiore e inferiore per l'acquisizione dell'immagine. Importa queste informazioni prima di eseguire l'esperimento.
   3. Per aiutare a minimizzare la fototossicità e il fotosbiancamento durante l'imaging time-lapse, ridurre il numero di Z-stack e scegliere il piano medio delle cellule per l'acquisizione dell'immagine.
6. Seleziona il set di filtri appropriato per l'esperimento usando la scheda design e poi canalizza nella finestra di dialogo progettazione/esecuzione dell'esperimento (TRITC: EX 542/27; EM 597/45; FITC/GFP: EX 475/28; EM 525/48; mCherry: EX 575/25; EM 632/60; Cy5: EX 632/22; EM 676/34).
   1. Inoltre, seleziona un riferimento per la raccolta delle informazioni POL/DIC. Regola la percentuale di trasmissione (intensità luminosa) e la durata dell'esposizione per i singoli canali selezionati prima dell'imaging selezionando le opzioni appropriate nella finestra di dialogo resolve3D .
      NOTA: In un campo visivo di test non considerato per l'esperimento, testare queste impostazioni per identificare se i parametri selezionati ottengono dati di fluorescenza significativi senza perdere un segnale debole o sovrasaturarlo. Poi importare questi parametri per l'assetto sperimentale.
7. Apri la lista dei punti selezionando il pulsante Elenco punti nella finestra di dialogo resolve3D . Dovrebbe apparire una nuova finestra di dialogo intitolata lista punti. Segna diversi campi visivi da utilizzare nell'esperimento trovando i campi visivi appropriati usando i controlli dello stadio del microscopio e selezionando l'opzione di segna punto nella finestra di dialogo della lista punti.
   NOTA: Un punto di sostituzione dovrà essere selezionato ogni volta che il microscopio viene rifocalizzato su un punto nell'elenco dei punti. Questo può essere fatto focalizzando il microscopio sul punto appropriato della lista e poi selezionando il pulsante di sostituisci il punto . È importante non toccare la manopola analogica di regolazione grossola/fine durante la rifocalizzazione; Usa solo il software per regolare la messa a fuoco.
8. Imposta i parametri del time-lapse selezionando prima la scheda design e poi time-lapse nella finestra di dialogo progettazione/esecuzione dell'esperimento. Seleziona la casella time-lapse. Inserisci i parametri time-lapse appropriati in termini di immagini time-lapse/tempo totale.
9. Impostare i punti da visualizzare dalla lista dei punti selezionando prima la scheda design e poi punti nella finestra di dialogo progetta/esecuzione dell'esperimento. Seleziona l'opzione elenco dei punti di visita e inserisci i punti da visualizzare nella casella di testo separata da virgole o trattini se la sequenza è completa.
10. Prima di iniziare un esperimento, modifica nomi e posizioni file usando la scheda esecuzione nella finestra di dialogo progetta/esegui. La posizione del file può essere modificata selezionando il pulsante impostazioni , selezionando la cartella dati e poi selezionando la cartella appropriata o creandone una nuova. Cambia il nome dei file inserendo il nuovo nome nel testo del nome del file immagine.
11. Inizia l'esperimento selezionando il pulsante play nella finestra di dialogo di inizio esperimento .
    NOTA: Per il time-lapse, controlla continuamente la messa a fuoco in ogni campo visivo durante l'esperimento usando l'impostazione DIC (per evitare fotosbiancamenti inutili) e rifocalizza e aggiorna le informazioni nella lista dei punti, poiché le celle tendono a perdere la messa a fuoco col tempo.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Agarose	BioReagenti Fisher	BP160-100	Grado di Biologia Molecolare - Basso EEO
FM4-64	Invitrogen	T3166	Microscopia
Piatto con fondo di vetro	MatTek	P35G-1.5-14-C	Microscopia
Microscopio	GE	DeltaVision Elite	Supporto personalizzato per microscopio rovesciato Olympus IX-71; Torre di illuminazione personalizzata e modulo illuminatore per luce trasmessa. Obiettivi: PLAPON 60X (N.A. 1.42, WD 0.15 mm); OLY 100X OLIO (N.A. 1.4, WD 0.12 mm); DIC Prism Nomarski per obiettivo 100X; CoolSnap HQ2; Assemblaggio SSI a 7 colori; Camera di controllo ambientale - opaca.
PC190723	MilliporeSigma	3445805MG	Inibitore FtsZ
SoftWorx	GE		Software di imaging fornito dal produttore