$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato locale istituzionale per la cura degli animali e dal comitato veterinario JoVE.
1. Inoculazione di Listeria monocytogenes nei topi tramite iniezione nella vena caudale e valutazione del carico batterico nel fegato, milza e cuore
NOTA: Tutti i lavori sugli animali vengono eseguiti secondo le linee guida CDC Biosafety Level 2. I topi vengono solitamente ordinati con una settimana di anticipo e messi in gabbia insieme a 5 animali per gabbia. I topi sono lasciati ad ambientarsi nel nuovo ambiente di laboratorio per quattro giorni prima dell'iniezione. Questi esperimenti hanno utilizzato femmine di topi Swiss-Webster di 6-8 settimane che sono state alloggiate da 5 per gabbia in un ambiente barriera e nutrite con una dieta non vincolata.
- Prepara una gabbia di topi alla volta rimuovendo il coperchio e i contenitori di cibo e acqua, e metti la gabbia sotto una lampada riscaldante per cinque minuti. Questo processo permette alle vene della coda di dilatarsi, rendendo più facile eseguire le iniezioni.
- Rimuovi un animale e mettilo in un'imbracatura (o in un tubo di falco con l'estremità tagliata) per immobilizzarlo durante l'iniezione.
- Pulisci il sito dell'iniezione usando un assorbente per l'alcol e lascia che l'alcol evapori. Questo non solo pulisce il sito, ma dilata ulteriormente la vena caudale.
- Utilizzando una siringa da 1 ml dotata di un ago calibro 27,5, inietta delicatamente nel topo 200 μl della coltura desiderata nella vena caudale.
- Usa una garza per fermare eventuali emorragie che potrebbero verificarsi a causa dell'iniezione e metti l'animale in una gabbia nuova.
- Ripeti questo processo per gli animali e le varietà rimanenti. Assicurati di etichettare ogni gabbia con la varietà che hanno ricevuto.
- Controlla quotidianamente gli animali, rimuovendo e sacrificando qualsiasi animale che sembri malata. Se nessun animale mostra segni di malattia, lascia che le infezioni continuino per 72 ore prima di sacrificare tutti gli animali.
- Per sacrificare, usare anestesia al CO2 da una fonte in bottiglia finché tutte le respirazioni non si sono fermate, poi usare la lussazione cervicale per assicurarsi che l'animale sia morto.
- Dopo il sacrificio, spostare gli animali in un cappuccio per la coltura dei tessuti per la dissezione.
- Usando un blocco di dissezione, fissa ogni gamba dell'animale con aghi di grande calibro e spruzza l'animale con il 70% di etanolo finché non si satura.
- Taglia la pelle dell'addome e del torace all'indietro usando un'incisione a forma di Y che si estende dall'apertura vaginale fino al processo xifoide, proseguendo poi fino all'ascella di ciascun braccio.
- Tira indietro la pelle e rimuovi gli aghi da ciascuna gamba per tenere aperta la dissezione.
- Taglia delicatamente il peritoneo, esponendo intestini, stomaco, fegato e milza.
- Tagliando prima la vena epatica e il legamento coronale nella parte superiore del fegato, si inizia a rimuovere il fegato. Altri legamenti da rimuovere si trovano sotto il fegato, collegandolo alla prima sezione dell'intestino tenue, così come alla muscolatura della schiena.
- Inserire il fegato in 5 ml di ddH20 sterile in un tubo falcon da 50 ml.
- Successivamente, rimuovere la milza isolandola e tagliando delicatamente vascolare e legamenti. La milza verrà rimossa più facilmente del fegato. Inserire la milza in un tubo separato con 5 ml sterile diddH 20.
- Individua il diaframma e taglia delicatamente lungo la gabbia toracica per visualizzare il torace. Taglia il processo xifoide e lo sterno fino al livello del collo per aprire il torace, esponendo cuore e polmoni.
- Con la pinza, afferra delicatamente il cuore per l'apice e sollevalo in modo che aorta e vasi polmonari siano in tensione. Taglia questi vasi per liberare il cuore.
- Inserire il cuore in un tubo falcon da 50 ml contenente 5 ml di ddH20 sterile.
- Scartare la carcassa del topo e ripetere questo processo per ogni animale, utilizzando tubi puliti per il falco contenenti 5 ml di ddHsterile 20 per ogni organo rimosso.
- Dopo che tutti gli organi sono stati rimossi, pulisci la postazione e torna al banco di lavoro.
- Prepara un set di 5 tubi da utilizzare per pulire e sterilizzare l'omogeneizzatore per ogni gruppo di organi provenienti da cinque topi (cioè un set da 5 tubi per 5 fegati, 5 tubi per 5 milze e 5 tubi per 5 cuori). Quattro tubi per ciascuno devono essere riempiti con 30 ml sterileddH 20, e uno con 30 ml di EtOH al 90%.
- Utilizzando un TissueMaster (o omogeneizzatore equivalente), immergi l'omogeneizzatore (mentre si usa) nei tubi preparati nel passo 1.21 come segue per pulire la sonda:
- Tubo 1 (ddH2O) 5 secondi nel Tubo 2 (ddH2O) 5 secondi nel Tubo 3 (EtOH) 5 secondi nel Tubo 4 (ddH2O) 5 secondi nel Tubo 5 (ddH2O)
- Omogeneizza un fegato usando l'omogeneizzatore per almeno 2 minuti, o finché non rimangono porzioni visibili dell'organo. Usa una pinzetta per rimuovere eventuali detriti grossi dalla sonda.
- Ripeti il processo di pulizia descritto.
- Ripeti il processo di omogeneizzazione per gli altri fegati, assicurandoti di lavare la sonda tra ciascun fegato seguendo il processo descritto.
- Dopo che tutti i fegati sono completamente omogeneizzati, si scartano i tubi di lavaggio (1-5) per il fegato.
- Ripeti il processo di omogeneizzazione/pulizia sia per la milza che per il cuore, assicurandoti di usare un nuovo set di tubi per lavaggio per ogni serie di organi. Se in qualsiasi momento i tubi di lavaggio diventano torbidi, scartali e sostituisci con nuovi tubi per completare la serie.
- Dopo che tutti gli organi sono stati omogeneizzati, fai un ultimo ciclo di pulizia sull'omogeneizzatore e asciugalo bene per la conservazione.
- Inserire circa 200 μl di ciascun organo in un singolo pozzo di una piastra a 96 pozzi.
- Eseguire diluizioni seriali sui campioni di organo diluendo 1:10 in serie fino a una diluizione 1:10.000 (fegato e milza) o fino a una diluizione 1:1.000 (cuore).
- Placca la serie di diluizione su lagar LB preriscaldato. Rimuovere inoltre 20 ul di ciascun organo non diluito e la placca su placche agar LB separate per poter enumerare la CFU da organi poco colonizzati.
- Scartare i tubi falcon contenenti gli organi omogeneizzati e avvolgere le piastre a 96 pozzi contenenti la serie di diluizione con parafilm e metterli in una scatola congelatrice a -80 °C.
- Lascia asciugare le macchie. Questo processo viene accelerato posizionando le piastre nel cappuccio e rimuovendo i coperchi.
- Dopo che le macchie si sono asciugate, si mettono le piastre in un incubatore a 37 °C per tutta la notte.
- Contare il numero di colonie in ogni punto la mattina seguente e utilizzare la serie di diluizione per calcolare il numero totale di batteri per organo.