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Tutte le procedure che coinvolgono campioni animali sono state esaminate e approvate dal comitato di revisione etica degli animali competente.
1. Infezione
- Procura topi BALB/c di entrambi i sessi tra le 10 e le 12 settimane di età.
NOTA: Streptococcus pneumoniae sierotipo 4 ceppo TIGR4 è un isolato clinico virulento che è stato sequenziato. - Coltivare TIGR4 nel brodo Todd-Hewitt a 37 °C con 5% di CO2 fino a raggiungere una densità ottica (OD) 620 di 0,5 (corrispondente a 1,0 x 10unità formanti colonia [CFU]/ml). Granulare la coltura pneumococcica per centrifugazione per 10 minuti a 3.500 x g e rimuovere il soprantantante usando una linea a vuoto. Sospendere e diluire i batteri con soluzione salina sterile tamponata con fosfato (PBS) fino a una concentrazione finale di 1,0 x 104 CFU/ml.
- Utilizzando una camera di induzione, anestetizzare i topi con isoflurano vaporizzato al 2,5% in ossigeno. Conferma lo stato anestetizzato con una delicata pizzica sul dito dei piedi con una pinzetta smussata.
- Tenendo il topo anestetizzato per la pelle del collo e in posizione eretta con una mano, iniettare a ciascun topo intraperitonealmente (i.p.) con 100 μl della sospensione di S. pneumoniae usando una siringa con ago calibro 27-30 (corrispondente a una dose di stimolazione di 1,0 x 103 CFU). Rimetti il topo nella sua gabbia. I topi si svegliano tipicamente 30-40 secondi dopo l'iniezione.
- Lascia che l'infezione progredisca per almeno 24 (all'inizio) o 30 (avanti) ore.
- Eutanasia dei topi tramite asfissia da CO2 . Esegui una lussazione cervicale per assicurarti che il topo sia deceduto. L'eutanasia è ulteriormente confermata dalla rimozione del cuore nello Step 1.6.
- Disinfetta la coda con un tampone d'alcol e taglia una sezione di 2-3 mm. Raccogliere 2 μl di sangue e diluire serialmente il sangue di 10 volte in PBS contenente eparina di sodio 1 U/ml cinque volte. Diluizioni seriali su una piastra triptica di sangue di soia e incubare durante la notte a 37 °C in 5% diCO2. Il giorno successivo si estrapola dalla colonia il livello di batteriemia.
- Immobilizza il topo in posizione supina su una piattaforma chirurgica. Spruzza il petto con etanolo al 70% e asciuga con un tamponino. Utilizzando forbici chirurgiche e pinzep, apri la cavità toracica, rimuovi la gabbia toracica e trasmetti il diaframma per esporre cuore e polmoni. Con forbici, taglia i vasi sanguigni collegati al cuore e estrai delicatamente il cuore con cura per evitare lividi con le pinze.
- Risciacquare il cuore con PBS e poi inserirlo in cassette di raccolta dei campioni di tessuto in modo che si ottengano sezioni coronali durante la sezionazione. Per l'incorporazione della paraffina, si applicano le cassette in una soluzione di formalina bufferizzata al 10% e il giorno successivo si invia l'incorporazione della paraffina.
- In alternativa, si può congelare improvvisamente utilizzando un composto a temperatura di taglio ottimale (O.C.T.) all'interno di un criomolo che è stato applicato su ghiaccio secco.
2. Visualizzazione delle lesioni cardiache e dei pneumococchi all'interno delle lesioni
- Tagliare le sezioni cardiache incastonate nella paraffina in modo che le 4 camere del cuore siano visibili in ciascuna sezione di tessuto. Taglia i vetri con uno spessore di 5 μm.
- Deparafinizza e colora i vetrini con ematossilina ed eosina (H&E) utilizzando metodi standard.
- Osserva le sezioni cardiache colorate con H&E usando un microscopio lucico a ingrandamenti bassi (100X, 200X) e alti (immersione in olio: 400X, 1.000X). Caratterizzare i cuori per la presenza di microlesioni nel miocardio. Qui, acquisire immagini H&E utilizzando un microscopio Zeiss Axioskop 2 dotato di un obiettivo Plan-NEOFLUAR ad apertura numerica 100X 1.3.
NOTA: Nelle fasi iniziali, le lesioni cardiache sono distinte per il loro colore diverso e in alcuni casi per la presenza di cellule immunitarie (monociti e granulociti), che sembrano monociti. Nelle lesioni avanzate, in particolare quelle osservate a 30 ore, le cellule immunitarie sono assenti e al loro posto si osservano grandi lesioni simili a vacuole. È importante notare che, sebbene possa verificarsi l'influsso di cellule immunitarie nelle prime fasi dello sviluppo della lesione cardiaca, non sembra essere un requisito.