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Tutte le procedure che coinvolgono campioni animali sono state esaminate e approvate dal comitato di revisione etica degli animali competente.
1. Infezione
- Procura topi BALB/c di entrambi i sessi tra le 10 e le 12 settimane.
NOTA: Streptococcus pneumoniae sierotipo 4 TIGR4 è un isolato clinico virulento che è stato sequenziato. - Coltivare TIGR4 nel brodo Todd-Hewitt a 37 °C con il 5% di CO2 fino a quando la coltura non raggiunge una densità ottica a 620 nm (OD620) di 0,5 (corrispondente a 1,0 × 10 unità formativedi 8 colonie [CFU]/ml). Granulare la coltura pneumococcica per centrifugazione per 10 minuti a 3.500 × g e rimuovere il soprantantante usando una linea a vuoto. Sospendere e diluire i batteri con soluzione salina sterile tamponata con fosfato (PBS) fino a una concentrazione finale di 1,0 × 104 CFU/ml.
- Utilizzando una camera di induzione, anestetizzare i topi con isoflurano vaporizzato al 2,5% in ossigeno. Conferma lo stato anestetizzato con una delicata pizzica sul dito dei piedi con una pinzetta smussata.
- Tenendo il topo anestetizzato per la pelle e in posizione eretta con una mano, iniettano ogni topo intraperitonealmente (i.p.) 100 μl della sospensione di S. pneumoniae usando una siringa con ago calibro 27-30 (corrispondente a una dose di sfida di 1,0 × 103 CFU). Rimetti il topo nella sua gabbia. I topi si risvegliano tipicamente 30-40 secondi dopo l'iniezione.
- Lascia che l'infezione progredisca per almeno 24 (all'inizio) o 30 (avanti) ore.
- Eutanasia i topi tramite asfissia da CO2. Esegui una lussazione cervicale per assicurarti che il topo sia deceduto. L'eutanasia è ulteriormente confermata dalla rimozione del cuore nello Step 1.6.
- Disinfetta la coda con un tampone d'alcol e taglia una sezione di 2-3 mm. Raccogliere 2 μl di sangue e diluire serialmente il sangue di 10 volte in PBS contenente eparina di sodio 1 U/ml cinque volte. Diluizioni seriali su una piastra triptica di sangue di soia e incubare durante la notte a 37 °C al 5% di CO2. Il giorno successivo si estrapola dalla colonia il livello di batteriemia.
- Immobilizza il topo in posizione supina su una piattaforma chirurgica. Spruzza il petto con etanolo al 70% e asciuga con un tamponino. Utilizzando forbici chirurgiche e pinzep, apri la cavità toracica, rimuovi la gabbia toracica e trasmetti il diaframma per esporre cuore e polmoni. Con forbici, taglia i vasi sanguigni collegati al cuore e estrai delicatamente il cuore con cura per evitare lividi con le pinze.
- Risciacquare il cuore con PBS e poi inserirlo in cassette di raccolta dei campioni di tessuto in modo che si ottengano sezioni coronali durante la sezionazione. Per l'incorporazione della paraffina, si applicano le cassette in una soluzione di formalina bufferizzata al 10% e il giorno successivo si invia l'incorporazione della paraffina.
- In alternativa, il congelamento improvviso utilizzando la Temperatura di Taglio Ottimale (O.C.T.) Composto all'interno di un criomold che è stato messo su ghiaccio secco.
2. Visualizzazione delle lesioni cardiache e dei pneumococchi all'interno delle lesioni
- Tagliare le sezioni cardiache incastonate nella paraffina in modo che le 4 camere del cuore siano visibili in ciascuna sezione di tessuto. Taglia i vetri con uno spessore di 5 μm.
- Deparafinizza e colora i vetrini con ematossilina ed eosina (H&E) utilizzando metodi standard.
- Osserva le sezioni cardiache colorate con H&E usando un microscopio lucico a ingrandimento basso (100×, 200×) e alto (immersione in olio: 400×, 1.000×). Caratterizzare i cuori per la presenza di microlesioni nel miocardio. Qui, acquisire immagini H&E utilizzando un microscopio Zeiss Axioskop 2 dotato di un obiettivo Plan-NEOFLUAR con apertura numerica 100× 1.3.
NOTA: Nelle fasi iniziali, le lesioni cardiache sono distinte per il loro colore diverso e in alcuni casi per la presenza di cellule immunitarie (monociti e granulociti), che sembrano monociti. Nelle lesioni avanzate, in particolare quelle osservate a 30 ore, le cellule immunitarie sono assenti e al loro posto si osservano grandi lesioni simili a vacuole. È importante notare che, sebbene possa verificarsi l'influsso di cellule immunitarie nelle prime fasi dello sviluppo della lesione cardiaca, non sembra essere un requisito.
3. Microscopia immunofluorescente per pneumococchi all'interno delle microlesioni
- Taglia il cuore in criomodelli con un microtomo fino a uno spessore di 5 μm e posiziona le sezioni su vetri di vetro caricati positivamente. Lascia scongelare le sezioni cardiache congelate e asciugare all'aria. Fissare le sezioni per 10 minuti in formalina tamponata al 10% di neutro (pH 6,8-7,2 a 25 °C).
- Lavare le vetri (3×) in PBS per 5 minuti, permeabilizzare per 15 minuti in Triton X-100 allo 0,2% in PBS, poi lavare di nuovo in PBS.
- Blocca la sezione del tessuto su vetrine con siero di capra al 10% in PBS per 1 ora.
- Risciacquare i vetrini con PBS, coprire e incubare le sezioni cardiache con antisiero antisierotipo 4 per coniglio al 1:1.000 in PBS con siero di capra al 10% per 2 ore a 37 °C.
NOTA: Per i controlli negativi, gli investigatori dovrebbero usare antisiero naïve rabbit - Dopo il lavaggio con PBS, coprire e incubare le sezioni con siero di capra al 10% - PBS con anticorpo coniugato con fluoresceina isotiocianato (FITC) anti-coniglio a 1:2.000 per 30 minuti a 37 °C.
- Seguendo le istruzioni del produttore, usa DAPI (4',6- Diamidino-2-Fenilindolo) a 5 mg/ml per la visualizzazione dei nuclei eucarioti. Lava e monta le sezioni di fazzoletto con FluorSave.
- Acquisire immagini fluorescenti utilizzando un sistema di microscopio confocale sia a basso che ad alto ingrandimento. Regola l'apertura numerica di conseguenza per ottenere risultati ottimali. Qui, acquisire immagini fluorescenti utilizzando un sistema confocale con un obiettivo di apertura numerico di 60× 1,42.