Rilevamento basato su PCR di patogeni alimentari da campioni di mosca arricchiti

Abstract

Fonte: Pava-Ripoll, et al. Rilevamento di patogeni batterici alimentari da singole mosche sporche. J. Vis. Esp. (2015)

Questo video dimostra un metodo basato su PCR che amplifica il DNA batterico bersaglio da campioni di mosca arricchita utilizzando compresse specifiche per il patogeno, consentendo la rilevazione in tempo reale della fluorescenza e l'analisi della curva di fusione per confermare la presenza di patogeni alimentari nei singoli insetti.

Protocollo

1. Compresse pronte per PCR idratato (reazione a catena della polimerasi)

1. Seleziona un blocco raffreddamento PCR raffreddato (4 °C) e posiziona un rack per tubi PCR sopra l'inserto.
2. Posiziona i tubi PCR corrispondenti contenenti le compresse pronte per PCR (incluse con ogni kit) per il patogeno alimentare bersaglio nel supporto, secondo il file del rack.
3. Utilizzando lo strumento per decapping, rimuovi con cura i tappi dai tubi PCR. Scartate i tappi e verificate che ogni tubo contenga una compressa.
4. Trasferire 50 μl (per Salmonella e Cronobacter) o 30 μl (per L. monocytogenes) di lisato a specifiche sonde PCR. Usa nuovi tappi ottici e fissali saldamente ai tubi PCR usando lo strumento di tappato.
   NOTA: Dopo aver aggiunto il lisato alle compresse pronte per PCR, i campioni devono rimanere raffreddati a 2-8 °C fino al caricamento nel sistema di rilevamento basato su PCR. I tubi PCR possono essere centrifugati a 2.500 x g per alcuni secondi per garantire che il volume completo sia sul fondo del tubo.
5. Carica i tubi PCR nello strumento del sistema di ciclo/rilevamento PCR aprendo il cassetto degli strumenti.
6. Metti il rack di tubi PCR nei pozzi nel cassetto e controlla che i tubi siano posizionati correttamente.
7. Chiudi il cassetto e avvia il programma come descritto dal protocollo del produttore.
   NOTA: Lo strumento basato sulla PCR ha parametri di ciclo preimpostati per ogni patogeno trasmesso dagli alimenti.
8. Verifica che la barra di stato del ciclo PCR mostri una barra blu che indica che la parte di amplificazione del programma è in esecuzione.
   NOTA: Per i test PCR standard, il tempo di elaborazione dell'intero programma (amplificazione e rilevamento) richiede circa 3 - 3,5 ore per essere completato.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Strumento di tappa	DuPont	D11677028
Strumento di decappamento	DuPont	D11134095
Rack/supporto per tubi PCR	DuPont	D12701663
Punta fine, pinze dritte	BioQuip	4731	Sterilizza prima di usarlo. Più fornitori.
Blocco di raffreddamento			Più fornitori.
Centrifuga			Più fornitori.