Un saggio rapido basato su immagini per lo screening della virulenza batterica indotta dalla superficie

Abstract

Fonte: Perinbam, K., e Siryaporn, A. Un rapido test di virulenza batterica basato su immagini utilizzando ameba. J. Vis. Esp. (2018)

Questo video dimostra un metodo rapido basato su immagini per valutare la virulenza batterica incubando amebe con batteri attaccati superficialmente o planctonici, applicando un cuscinetto di calcina-acetossimetilestere (calceina-AM) di agarosio e imaging della fluorescenza per rilevare danni alle cellule ospiti.

Protocollo

1. Microscopia - Preparazione del tampone agario

1. Prepara i cuscinetti agar circa 30 minuti a 1 ora prima che le amebe siano pronte per essere mescolate con Pseudomonas aeruginosa.
2. Microonde 50 mL di agar all'1% (p/v) in un tampone di sviluppo (DB) in una fiaschetta da 250 mL. Mescola ogni 20 secondi finché i grumi di agar scompaiono.
3. Raffredda l'agar fuso mettendolo in un bagno d'acqua preriscaldato a 55 °C per 15 minuti.
4. Aggiungere 15 μL della soluzione stocca calceina-AM a 15 mL dell'agar fuso in un tubo conico. Mescola invertendo delicatamente il tubo 4-5 volte e procedi immediatamente al passaggio successivo.
   NOTA: Esegui questo passaggio in un tubo centrifuga in polipropilene da 15 mL. Non usare un contenitore di vetro spesso, perché questo farà solidificare l'agar troppo rapidamente.
5. Versare la miscela di agar fuso sopra una piastra di vetro da 12 cm x 10 cm e lasciare che l'agar si solidifichi per 10 minuti a temperatura ambiente. Taglia il tampone di agario solidificato in sezioni più piccole di 1,5 cm x 1,5 cm posizionando la lastra di vetro su una griglia stampata e tagliando lungo la griglia usando un righello metallico.
6. Tieni il gel idratato in una scatola umida finché non è pronto all'uso.

2. Microscopia - Preparazione del campione di batteri-amebe per l'imaging

1. Per analizzare la virulenza delle cellule batteriche attaccate alla superficie, si aggiungono 10 μL di cellule di ameba ai batteri attaccati alla superficie.
   NOTA: Questo passaggio descrive la miscelazione di amebe con batteri.
2. Per analizzare la virulenza delle cellule planctoniche, si mescolano 10 μL di cellule amebe con 10 μL di batteri planctonici.
   NOTA: Non lavare le cellule di ameba cresciute asinicamente (a un OD₆₀₀ di 0,2-0,5) prima di mescolarle con i batteri. Non si osserva alcuna crescita di E. coli nella coltura di ameba grazie all'uso della soluzione antibiotica-antimicotica.
3. Posizionare immediatamente il tampone agar calceina-AM di 1,5 cm x 1,5 cm del passo 1,5 sopra la miscela batterio-ameba sulla superficie della piastra di Petri.
   NOTA: Posiziona il tampone d'agar sopra la miscela con un movimento rapido e fluido. Non abbassare lentamente il pad sulla miscela, poiché questo movimento tende a spingere le cellule verso la periferia e lontano dalla parte inferiore del pad. Questo passaggio garantirà che batteri e amebe siano mescolati uniformemente, immobilizzati e che entrambi i tipi cellulari siano confinati nello stesso piano.
4. Rimuovere il liquido in eccesso pipettando delicatamente qualsiasi residuo intorno all'agar pad. Lascia asciugare la piastra di Petri per 20 minuti a temperatura ambiente.
5. Copri la piastra di Petri con un coperchio e incuba la miscela immobilizzata di ameba e batteri a temperatura ambiente per altri 40 minuti. Procedi al passo 3.1.
   NOTA: È importante incubare tutti i campioni per lo stesso intervallo di tempo, poiché la fluorescenza di fondo aumenta nel tempo. Si raccomanda un tempo di incubazione di 1 ora. Le incubazioni di più di 1 ora sono meno riproducibili poiché le cellule delle amebe possono iniziare a rompersi.

3. Microscopia - Acquisizione di immagini

1. Immagini le amebe utilizzando un microscopio a fluorescenza in grado di acquisire immagini a campo chiaro e fluorescente verde. Per la fluorescenza verde, si utilizzano filtri a proteina di fluorescenza verde (GFP) rispettivamente con 474/27 nm e 525/45 nm per eccitazione ed emissione. Usa un obiettivo 10X (apertura numerica ≥0,3) per visualizzare le amebe.
   NOTA: La calcina-AM nell'agar farà fluorescere le amebbe morenti nel canale di fluorescenza verde. Le amebe sane altrimenti non sono fluorescenti.
2. Regolare i tempi di acquisizione per il contrasto di fase, canali GFP per limitare la fototossicità e ottimizzare la gamma dinamica delle intensità dell'immagine. Se necessario, sostituire il contrasto di fase del contrasto differenziale di interferenza (DIC).
   NOTA: Usa esposizioni da 100 a 200 ms per contrasto di fase e fluorescenza GFP se possibile. Mantieni invariate le impostazioni di esposizione e strumenti per tutto l'esperimento. Questo è fondamentale per calcolare l'indice di uccisione dell'ospite.
3. Acquisire immagini di almeno 100 cellule di ameba per ottenere buone statistiche per calcolare l'indice di uccisione dell'ospite.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Reagenti
Agar bacto, disidratato	BD Difco	214010
Antibiotico-Antimicotico (100X)	Life Technologies	15240062	Aloquote < 1 mL e conservate a -20 °C
Estere acetossimetilico di calceina (calcina-AM)	Life Technologies	C34852	Calceina Acetossimetil (AM)
Cloruro di calcio, anidro	Sigma-Aldrich	C1016
D-Glucosio	Fisher Chemical	D16500	Destrosio
Dimetilsolfossido	Sigma-Aldrich	D5879
Acido folico	Sigma-Aldrich	F8758
LB-Miller	BD Difco	244620
Cloruro di magnesio	Sigma-Aldrich	M8266
Estratto di lievito	Ossassoide	LP0021
Peptone speciale	Ossassoide	LP0072
Isossido di potassio	Fisher Chemical	P250
Monobasico fosfato di potassio	Sigma-Aldrich	P0662
Fosfato di sodio dibase eptaidrato	Fisher Chemical	S373
Vitamina B12	Sigma-Aldrich	V2876
Ceppi
Dictyostelium discoideum	Laboratorio Siryaporn	Strain AX318
Escherichia coli	Laboratorio Siryaporn	Ceppo B/r17
Pseudomonas aeruginosa	Laboratorio Siryaporn	PA14	Ceppo PA14
Pseudomonas aeruginosa ΔlasR	Laboratorio Siryaporn	AFS20.1	Ceppo 20 derivato da PA14
Forniture
Filtro da 0,22 μm	Millipore	SCGPT01RE	Per la sterilizzazione del filtro
Tubo conico, 15 mL	Corning	352097
Bottiglie di vetro per conservare	Pyrex	13951L	250 mL, 500 mL, 1000 mL
Piastra di Petri, 6 cm di diametro	Corning	351007	Placche in polistirene 60 x 15 mm
Piastra di Petri, diametro 10 cm	Fisher	FB0875712	Piastre in polistirene da 100 x 15 mm
Contenitori di plastica con coperchio	Ziploc	2.57E+09	Contenitori quadrati da 3 tazze
Lastre di vetro	Bio-Rad	1653308	Per preparare i cuscinetti d'agaro. Possono essere usate altre lastre di vetro con dimensioni simili.
Bastoncini di legno	Fisher	23-400-102
Equipaggiamento
Microscopio Eclipse Ti-E	Nikon	MEA53100	Installazione del microscopio
10X Plan Fluor Ph1 obiettivo 0,3 NA	Nikon	MRH20101	Installazione del microscopio
Sorgente di eccitazione a fluorescenza	Lumencor	Motore leggero Sola	Installazione del microscopio
Set di filtri a fluorescenza	Semrock	LED-DA/FI/TX-3X3M-A-000	Installazione del microscopio
Fotocamera Orca Flash 4.0 V2	Hamamatsu	77054098	Installazione del microscopio
ImageJ	NIH	v. 1.49	Software per l'analisi delle immagini
MATLAB	Mathworks	R2013	Software per l'analisi delle immagini
Incubatore a shaker orbitale	VWR	89032-092	Per la crescita batterica a 37 °C
Scuottore di piattaforma	Fisher	13-687-700	Per la crescita di amebe a 22 °C
Spettrofotometro	Biochrom	Ultrospec 10
Incubatore refrigerato sotto il bancone	Fisher	97990E	Per la crescita di amebe a 22 °C
Bagno d'acqua isotemp	Fisher	15-462-21Q	Per il mezzo di raffreddamento fino a 55 °C