Valutazione della carica batterica nella milza del topo per studi di infezione

Abstract

Fonte: Madenspacher, J. H. e Fessler, M. B. Un metodo non invasivo e tecnicamente non intensivo per l'induzione e la fenotipizzazione della polmonite batterica sperimentale nei topi. J. Vis. Esp. (2016)

Questo video mostra il processo di quantificazione del carico batterico nella milza di un topo infetto per valutare la gravità dell'infezione. La milza omogeneizzata viene diluita serialmente e placcata per determinare il carico batterico totale. I dati risultanti forniscono indicazioni sulle interazioni ospite-patogeno all'interno del tessuto sistemico.

Protocollo

Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato locale istituzionale per la cura degli animali e dal comitato veterinario JoVE.

1. Aspirazione intratracheale murina di Klebsiella pneumoniae dall'orofaringe

Assicurati che i topi siano identificati in modo unico tramite il segno della coda, il tatuaggio o un altro identificatore approvato.
Prelevare un inoculo dosificante dei batteri utilizzando una pipetta P200 prima di rimuovere i topi dall'isoflurano per accelerare la procedura. Per ottenere i migliori risultati con l'aspirazione di i.t., si utilizza un volume di <100 μl per evitare il traboccamento. In questo caso, utilizzare 2000 unità formative di colonie (CFU)/50 μl di K. pneumoniae.
Anestetizzare i topi in una camera trasparente con gas isoflurano (ad esempio, 2% di isoflurano a portata di 1 L/min) o secondo le linee guida istituzionali. Il numero di topi da anestetizzare insieme è determinato dal livello di comfort dell'esperimentatore, tipicamente 1-2 alla volta. Osserva la respirazione e conferma il livello di anestesia una volta visibili respiri profondi e si possono contare 2-3 secondi tra un respiro e l'altro. NOTA: Se ci sono preoccupazioni per possibili effetti di confusione degli anestetici volatili (inalati), l'anestesia può essere ottenuta invece con l'iniezione intraperitoneale di ketamina/xilazina. Con il metodo descritto sopra, l'anestesia profonda dura solo pochi minuti. Se viene indotta un'anestesia prolungata, si dovrebbe usare una pomata oculare per prevenire la disidratazione oculare.
Una volta anestetizzato, si posiziona in posizione semi-reclinata supina, sospesa dagli incisivi maxillari da un elastico teso tra i perni su una tavola inclinata in Plexiglas (Figura 1).
Tira delicatamente la lingua del topo di lato con una pinza smussata e non scanalata e deposita la dose nella cavità orale con una pipetta P200. Fai molta attenzione per evitare di causare traumi sia alla lingua che all'orofaringe.
Mantenendo la lingua ritratta, occludi delicatamente il naso con un dito guantato, finché il topo non inspira. Continuare a coprire il naso finché il topo non ha fatto due o più inalazioni e non si vede alcun liquido nella cavità orale. Coprire il naso aiuta a garantire che il topo inali i batteri nei polmoni, poiché i topi sono obbligati a respirare dal naso.
Rimuovi il topo dalla tavola di inoculazione e riporta nella sua gabbia, posizionandolo sulla schiena per evitare che la lettiera o i detriti ostruiscano le narici mentre si riprende dall'anestesia.
Una volta che tutti i topi sono stati somministrati e si sono svegliati dall'anestesia, si trovano topi domestici in un cubicolo/stanza che contiene solo topi che sono stati dosati con K. pneumoniae. Monitora i topi ogni giorno, compreso il peso corporeo, se superi le 48 ore dall'infezione.
Usa la mossa quotidiana e/o calore supplementare se lasci che i topi superino le 48 ore.

2. Determinazione del carico batterico nei tessuti polmonari e periferici

Prima di iniziare: preparare tubi diluitivi con 900 μl di 1x soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) per polmoni e milza e 90 μl di 1x PBS per il sangue. Etichette piastre per la coltivazione dei batteri e fissare a temperatura ambiente; Pertanto, una volta raccolto il tessuto, il tempo sarà minimizzato tra l'omogeneizzazione e la placcatura per la crescita batterica.
NOTA: A causa della deposizione eterogenea di batteri nei polmoni che può verificarsi con aspirazione, si raccomanda di utilizzare singoli topi per l'analisi sia della cellularità totale delle vie aeree sia del carico batterico totale (bilaterale) polmonare.
Eutanasia i topi secondo le linee guida istituzionali. Qui, si utilizza un'iniezione letale di 150 mg/kg di pentobarbital sodio o una dose equivalente di soluzione commerciale per l'eutanasia, seguita da dissanguamento, poiché ciò evita possibili complicazioni ai polmoni associate all'inalazione di CO₂ e alla lussazione cervicale.
Rimuovi la milza e mettila in 2 ml di 1x PBS. Metti i tubi sul ghiaccio. Fai attenzione a pulire gli strumenti con etanolo tra ogni fazzoletto/mouse.
Omogeneizzare il tessuto sul ghiaccio, preferibilmente con omogeneizzatori usa e getta che possono essere cambiati tra ogni campione. Le punte omogeneizzatrici usa e getta possono essere autoclavate per essere riutilizzate tra un esperimento e l'altro.
Una volta omogeneizzato il tessuto, eseguire diluizioni seriali e placcare. Campioni di piastra di un dato tessuto/diluizione in duplicato su una singola piastra triptica di agar di soia (TSA) tracciando una linea di demarcazione sulla plastica. Le raccomandazioni per placcare e diluizione sono mostrate di seguito (in tutti i casi, 10 μl di campione vengono distribuiti sulla placca) e si basano su una necropsia di 24 ore dopo l'infezione. Se si analizzano campioni da 48-72 ore, potrebbe essere necessario impiantare un numero maggiore di diluizioni a causa dell'aumento del carico batterico in momenti successivi
1. Per la milza - diluire 1:10-1:100 aggiungendo 100 μl di milza omogeneizzata in 900 μl di PBS sterile 1x in serie di serie. Piastra ordinata omogenea e entrambe le diluizioni in duplicato.
Lascia asciugare brevemente i campioni di spalma.
Inverti le piastre TSA e mettilo in un incubatore statico a 37 °C durante la notte.
Determina il numero di batteri colonizzatori facendo la media delle colonie batteriche da entrambi i lati della piastra e da ciascuna diluizione. Si considerano le diluizioni iniziali di 5 ml per il polmone e 2 ml per la milza per determinare le CFU totali del tessuto.

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Risultati

Figura 1: Comitato per la polmonite da aspirazione nei topi. I topi di studio sono posizionati, con la testa sollevata e di nuovo contro la tavola (cioè semireclinati), sospesi dagli incisivi da un elastico teso tra due perni mon...