Visualizzazione dei metaboliti degli amminoacidi nei tessuti intestinali dei topi infetti

Abstract

Fonte: Specker, J. T., et al. Indagine della cooperazione microbica tramite analisi di spettrometria di massa per immagini di colonie batteriche coltivate su agar e nei tessuti durante l'infezione. J. Vis. Esp. (2022)

Questo video dimostra l'uso della spettrometria di massa assistita da laser a matrice (MALDI) per visualizzare la distribuzione degli amminoacidi nei tessuti intestinali di topi infettati da Clostridioides difficile, da solo o in combinazione con Enterococcus faecalis. La procedura prevede la preparazione dei tessuti, l'applicazione della matrice, l'ionizzazione laser e la rilevazione di ioni amminoacidi per generare immagini spaziali degli ioni. I risultati rivelano la cooperazione microbica, poiché E. faecalis altera l'ambiente intestinale rilasciando ornitina e impaurendo l'arginina, aumentando così la patogenesi di C. difficile .

Protocollo

Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato locale istituzionale per la cura degli animali e dal comitato veterinario JoVE.

1. Preparazione e spedizione di tessuti cecali topi non infetti e infestati da C. difficile
   1. Inoculare i topi maschi di 4-8 settimane con C57BL/6 maschi con antibiotici (0,5 mg/mL cefoperazone o 0,5 mg/mL cefoperazone + 1 mg/mL vancomicina) in acqua potabile ad libitum per 5 giorni, seguiti da un periodo di recupero di 2 giorni e da un'infezione successiva.
   2. Eutanasia gli animali tramite asfissia da CO_2<....

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Filtri a siringa Titan3 da 0,2 μm	Thermo Scientific	42225-NN
Matrice MALDI 1,5-diaminonaftalene	Sigma Aldrich	2243-62-1
Siringhe Henke Ject luer lock da 20 mL	Henke Sass Lupo	4200.000V0
Manometro a vuoto a convezione serie 275i	Azienda Kurt J. Lesker	KJL275807LL
Spettrometro di massa 7T solariX FTICR equipaggiato con un sistema laser Smartbeam II Nd:YAG MALDI (2 kHz, 355 nm)	Bruker Daltonics
Soluzione di acido acetico, adatta per l'HPLC	Sigma Aldrich	64-19-7
Acetonitrile, adatto per HPLC, grado gradiente, ≥99,9%	Sigma Aldrich	75-05-8
Soluzione di idrossido di ammonio, 28% di NH3 in H2O, ≥99,99% base di metalli traccia	Sigma Aldrich	1336-21-6
Sacchi autoclavabili per i rischi biologici: 55 galloni	Grainger	45TV10
Borse per il trasporto di campioni biologici (8 x 8 in.)	Fisher Scientific	01-800-07
Brodo per infusione cervello e cuore	BD in Biologia	90003-040
C57BL/6 maschi	Jackson Laboratories
Scanner fotografico e documenti CanoScan 9000F Mark II	Canon
CM 3050S criomicrotomo di ricerca	Leica Biosystems
Armadio disidratatore	Sigma Aldrich	Z268135
Scrittore di punta diamantata, Electron Microscopy Sciences	Fisher Scientific	50-254-51
Pellet dissiccanti di dririte	Drierite	21005
Etanolo, 200 proof	Decon Labs	2701
Software flexImaging	Bruker Daltonics
Software ftmsControl	Bruker Daltonics
Trappola a vuoto in vetro	Sigma Aldrich	Z549460
Spruzzatore robotico HTX M5 TM	Tecnologie HTX
Vetri da microscopio rivestiti con ossido di stagno di indio (ITO)	Delta Technologies	CG-81IN-S115
Filtro HEPA in linea a pompa a vuoto	LABCONCO	7386500
Metanolo, grado HPLC	Fisher Chemical	67-56-1
Adattatore a scorrimento MTP II	Bruker Daltonics	235380
Composto a temperatura ottimale di taglio (OCT)	Fischer Scientific	23-730-571
Sporicido, Disinfettante e Detergente RTU Peridox	CONTEC	CR85335
Vetrine stampate in PTFE (Teflon), Electron Microscopy Sciences	VWR	100488-874
Pompa a vuoto a palette rotative RV8	Edwards	A65401903
Lamette microtomi usa e getta ad alto profilo Tissue-Tek Accu-Edge	Scienze della microscopia elettronica	63068-HP
Tubo a vuoto trasparente	Cole Palmer	EW-06414-30
Olio per pompa a vuoto Ultragrade 19	Edwards	H11025011
Trasformatore a tensione variabile	Powerstat
Acqua, adatta per HPLC	Sigma Aldrich	7732-18-5
Fiaschetta dewar a bocca larga	Sigma Aldrich	Z120790