Visualizzazione dei metaboliti degli amminoacidi nei tessuti intestinali dei topi infetti

Abstract

Fonte: Specker, J. T., et al. Indagine della cooperazione microbica tramite analisi di spettrometria di massa per immagini di colonie batteriche coltivate su agar e nei tessuti durante l'infezione. J. Vis. Esp. (2022)

Questo video dimostra l'uso della spettrometria di massa assistita da laser a matrice (MALDI) per visualizzare la distribuzione degli amminoacidi nei tessuti intestinali di topi infettati da Clostridioides difficile, da solo o in combinazione con Enterococcus faecalis. La procedura prevede la preparazione dei tessuti, l'applicazione della matrice, l'ionizzazione laser e la rilevazione di ioni amminoacidi per generare immagini spaziali degli ioni. I risultati rivelano la cooperazione microbica, poiché E. faecalis altera l'ambiente intestinale rilasciando ornitina e impaurendo l'arginina, aumentando così la patogenesi di C. difficile .

Protocollo

Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato locale istituzionale per la cura degli animali e dal comitato veterinario JoVE.

1. Preparazione e spedizione di tessuti cecali topi non infetti e infestati da C. difficile
   1. Inoculare i topi maschi di 4-8 settimane con C57BL/6 maschi con antibiotici (0,5 mg/mL cefoperazone o 0,5 mg/mL cefoperazone + 1 mg/mL vancomicina) in acqua potabile ad libitum per 5 giorni, seguiti da un periodo di recupero di 2 giorni e da un'infezione successiva.
   2. Eutanasia gli animali tramite asfissia da CO₂ e preleva immediatamente l'organo ceco del topo. Immergi in una miscela al 20% di composto a temperatura ottimale di taglio (OCT) in acqua distillata.
   3. Mettere i campioni su ghiaccio secco, poi imballare e spedire per l'analisi; conservare a -80 °C fino all'analisi.

 

2. Criosezionamento del controllo non infetto contro i tessuti cecali del topo infetti da C. difficile

1. Pulire tutte le apparecchiature di criosezionamento risciacquando con etanolo al 100% e lasciarlo asciugare prima di inserire i campioni nella camera criostatica. Prepara le vetricelle rivestite con ITO utilizzando un ohmmetro per identificare il lato del vetrino con il rivestimento conduttivo. Usa una scava con punta diamantata per incidere e etichettare il lato rivestito con ITO del vetrito del microscopio.
   NOTA: Devono essere indossati dispositivi di protezione individuale adeguati, inclusi guanti, occhiali da laboratorio, camice da laboratorio e maniche criostatiche.
2. Esegui criosezionamento su un criomicrotomo di ricerca. Trasferire i tessuti ceca del topo incorporati in OCT da un congelatore a -80 °C alla camera criomicrotome (temperatura camera 30 °C, temperatura oggetto a -28 °C) su ghiaccio secco. Montare i campioni di tessuto da confrontare tramite spettrometria di massa per immagini (ad esempio, controllo non infetto vs. infetto da C. difficile) sullo stesso vetrino del microscopio per garantire una preparazione identica del campione di entrambi i tipi di tessuto e consentire confronti accurati dei metaboliti.
3. All'interno della camera criomicrotomica, montare il tessuto incorporato in OCT su un mandrone di campione utilizzando una soluzione OCT aggiuntiva. Dopo che la soluzione OCT si è solidificata, fissa il mandrino alla testa del campione. Iniziare la criosezione a incrementi di 10-50 μm per raggiungere la profondità/piano tessutale desiderato dell'organo.
4. Una volta raggiunta una sezione trasversale ottimale del tessuto, si inizia a raccolgere sezioni a uno spessore di 12 μm. Maneggia delicatamente la fetta con pennelli da artista e posizionala su un vetrino di microscopio rivestito in Teflon.
5. Arrotola il vetrino rivestito con ITO sopra la sezione di tessuto per raccogliere il tessuto dal vetrino rivestito in Teflon. Scongelare la sezione di tessuto sul vetrino del microscopio premendo il palmo sul retro del vetrino rivestito con ITO. Continua a scongelare il supporto finché la sezione del tessuto non passa da traslucida a opaca/opaca.
6. Trasferire le vetrine del microscopio montate su tessuto su ghiaccio secco in una scatola asciutta con essiccante per la conservazione per l'analisi nello stesso giorno, oppure conservare a -80 °C per una conservazione a lungo termine.

3. Preparazione di tessuti cecali di topo non infetti contro C. difficile per l'applicazione della matrice e la spettrometria di massa di imaging MALDI

1. Eseguire applicazione della matrice MALDI (temperatura dell'ugello a 30 °C, otto passate, portata 0,1 mL/min, schema CC, tempo di asciugatura 0 s, 10 psi).
2. Eseguire la spettrometria di massa per immagini MALDI
3. Analizza le immagini ioniche di più repliche biologiche e confronta i risultati per la significatività tramite confronti di diagrammi a box di intensità utilizzando il software statistico SCiLS citato sopra.
   NOTA: I test statistici e i confronti appropriati dipenderanno dall'applicazione e possono includere segmentazione spaziale, modelli di classificazione e analisi comparative per determinare caratteristiche spettrali discriminative e correlate. Le analisi comparative possono includere l'assegnazione di p-value a caratteristiche significative, la generazione di analisi a componenti principali per confronti tessuti e la visualizzazione di box plot per identificare variazioni. È inoltre utile visualizzare il tessuto utilizzando la microscopia a campo chiaro della sezione tisulare colorata tramite ematossilina ed eosina (H&E) dopo la spettrometria di massa per imaging. Ciò consente di identificare chiaramente le caratteristiche morfologiche nel tessuto e può essere analizzato in consultazione con un patologo qualificato.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Filtri a siringa Titan3 da 0,2 μm	Thermo Scientific	42225-NN
Matrice MALDI 1,5-diaminonaftalene	Sigma Aldrich	2243-62-1
Siringhe Henke Ject luer lock da 20 mL	Henke Sass Lupo	4200.000V0
Manometro a vuoto a convezione serie 275i	Azienda Kurt J. Lesker	KJL275807LL
Spettrometro di massa 7T solariX FTICR equipaggiato con un sistema laser Smartbeam II Nd:YAG MALDI (2 kHz, 355 nm)	Bruker Daltonics
Soluzione di acido acetico, adatta per l'HPLC	Sigma Aldrich	64-19-7
Acetonitrile, adatto per HPLC, grado gradiente, ≥99,9%	Sigma Aldrich	75-05-8
Soluzione di idrossido di ammonio, 28% di NH3 in H2O, ≥99,99% base di metalli traccia	Sigma Aldrich	1336-21-6
Sacchi autoclavabili per i rischi biologici: 55 galloni	Grainger	45TV10
Borse per il trasporto di campioni biologici (8 x 8 in.)	Fisher Scientific	01-800-07
Brodo per infusione cervello e cuore	BD in Biologia	90003-040
C57BL/6 maschi	Jackson Laboratories
Scanner fotografico e documenti CanoScan 9000F Mark II	Canon
CM 3050S criomicrotomo di ricerca	Leica Biosystems
Armadio disidratatore	Sigma Aldrich	Z268135
Scrittore di punta diamantata, Electron Microscopy Sciences	Fisher Scientific	50-254-51
Pellet dissiccanti di dririte	Drierite	21005
Etanolo, 200 proof	Decon Labs	2701
Software flexImaging	Bruker Daltonics
Software ftmsControl	Bruker Daltonics
Trappola a vuoto in vetro	Sigma Aldrich	Z549460
Spruzzatore robotico HTX M5 TM	Tecnologie HTX
Vetri da microscopio rivestiti con ossido di stagno di indio (ITO)	Delta Technologies	CG-81IN-S115
Filtro HEPA in linea a pompa a vuoto	LABCONCO	7386500
Metanolo, grado HPLC	Fisher Chemical	67-56-1
Adattatore a scorrimento MTP II	Bruker Daltonics	235380
Composto a temperatura ottimale di taglio (OCT)	Fischer Scientific	23-730-571
Sporicido, Disinfettante e Detergente RTU Peridox	CONTEC	CR85335
Vetrine stampate in PTFE (Teflon), Electron Microscopy Sciences	VWR	100488-874
Pompa a vuoto a palette rotative RV8	Edwards	A65401903
Lamette microtomi usa e getta ad alto profilo Tissue-Tek Accu-Edge	Scienze della microscopia elettronica	63068-HP
Tubo a vuoto trasparente	Cole Palmer	EW-06414-30
Olio per pompa a vuoto Ultragrade 19	Edwards	H11025011
Trasformatore a tensione variabile	Powerstat
Acqua, adatta per HPLC	Sigma Aldrich	7732-18-5
Fiaschetta dewar a bocca larga	Sigma Aldrich	Z120790