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1. Valutazione dell'effetto degli inibitori di piccole molecole sulla formazione di pellicole e colonie di biofilm
- Prepara una soluzione 2x di mezzo MSgg (glutammato-glicerolo monosodico) definito che induce biofilm senza cloruro di calcio e cloruro di ferro(III) esaidrato. Dopo la sterilizzazione con filtro, aggiungi il cloruro di calcio. Il mezzo è pronto all'uso direttamente, oppure può essere conservato a 4 °C al buio.
- Prepara la diluizione 1x MSgg il giorno dell'esperimento.
- Diluire il mezzo 2x MSgg a 1x con acqua distillata sterile (pellicoli) o agar sterile al 3% caldo (80 °C) (biofilm) e aggiungere cloruro di ferro(III) esaidrato a una concentrazione finale di 50 μM (pellicoli) o 250 μM (biofilm). Aggiungi antibiotici o inibitori a piccole molecole alla concentrazione desiderata e mescola bene. Ad esempio, per ottenere una concentrazione finale di 0,5 mM di D-leucina in 30 ml per stabilire pellicole o biofilm, aggiungere 196,6 μl di una soluzione stock di D-leucina da 76,3 mM (10 mg/ml).
NOTA: La composizione finale 1x MSgg è descritta nella Tabella 1. Rispetto alla ricetta originale, il mezzo conteneva 50 μg/ml di treonina, e la concentrazione di ferro per far crescere colonie di biofilm su un mezzo solido MSgg fu aumentata di 2,5 volte per ottimizzare la morfologia delle colonie rugose.
- Dopo la solidificazione dell'agar, asciugare le piastre solide di MSgg in un cappuccio biologico per 30-45 minuti prima dell'inoculazione.
- Per selezionare inibitori specifici che interferiscono con i meccanismi di formazione delle pellicole (Figura 1), escludere che le concentrazioni utilizzate influenzino la crescita planctonica e statica.
- Determinare la crescita planctonica (aumento della densità ottica nel tempo in coltura liquida) in una semplice curva di crescita misurando la densità ottica a 600 nm ogni ora fino alla fase di crescita stazionaria.
- Per confermare che la torbidità misurata della coltura rappresenta il conteggio delle cellule vive, determinare il numero di unità formative di colonie (CFU) di cellule nella fase di crescita planctonica da una coltura a scuotimento in diversi momenti.
- Per valutare l'effetto degli inibitori delle piccole molecole sulla crescita statica delle pellicole, prelevare cellule al termine di un'incubazione di 3 giorni a 23 °C da un pozzo di coltura cellulare a 24 pozzi, inoculato nelle stesse condizioni descritte nelle sezioni 1.7-1.9, e determinare la CFU. Per questo controllo, si utilizza una deformazione priva di pellicola che non contiene gli operoni che codificano le componenti della matrice extracellulare (ad esempio, B. subtilis ΔepsH, ΔtasA).
NOTA: Questo ceppo è in grado di crescere in condizioni statiche, ma a differenza di un tipo selvatico che forma pellicole è carente nella capacità di galleggiare fino all'interfaccia aria-liquido, dove la crescita è favorita a causa dell'aumento dei livelli di ossigeno. Pertanto, questo ceppo extracellulare carente di matrice e pellicola è un ceppo di riferimento raccomandato per valutare la crescita in condizioni statiche.
NOTA: Per l'esempio specifico dell'amminoacido D non canonico D-leucina descritto di seguito, è stato escluso un effetto sulla crescita planctonica e statica a concentrazioni che interferivano con la formazione della pellicola. I metodi per determinare la crescita planctonica e statica sono descritti in dettaglio.
- Stira B. subtilis da un stock a -80 °C (coltura LB di 109 cellule/ml congelate in glicerolo al 20%) per isolare singole colonie su una piastra agar LB-1,5% con una punta sterile o un bastoncino applicatore.
- Coltiva durante la notte a 30 °C.
- PASSO CRITICO: Per un'inibizione robusta della pellicola da parte degli amminoacidi D non canonici come la D-leucina, si coltiva una singola colonia prelevata dalla piastra di agar LB-1,5% in un brodo da 3 ml LB a 37 °C per 4 ore in un incubatore a scuotimento (velocità di agitazione 200 rpm). Sostituire il brodo LB con un mezzo MSgg che induce biofilm prima dell'inoculazione, centrifugando 1,5 ml di coltura starter per 4 minuti a 6.000 x g, rimuovendo con cura il surnatante e risospendendo il pellet in 1,5 ml di mezzo MSgg. Il resto della cultura può essere abbandonato. Importante: Per garantire la robustezza del sistema, la densità ottica a 600 nm (OD600) della coltura di avviamento lavata dovrebbe essere compresa tra 0,6 e 1.
- Durante la crescita della coltura starter, preparare una piastra multipiatto per coltura cellulare a 12 pozzi contenente 3 ml di mezzo MSgg senza o con un intervallo di concentrazione dell'inibitore delle piccole molecole (ad esempio, 0,3, 0,5, 1 mM di D-leucina). Per escludere effetti di bordo, distribuisci la posizione delle diverse concentrazioni lungo la piastra multipiatto. In alternativa, utilizzare piastre multipiatto a 24 pozzi per la cultura cellulare contenenti 1,5 ml di mezzo MSgg.
- Inoculare i pozzi della piastra multipiatto a 12 pozzetti per la coltura cellulare con 3 μl della coltura starter lavata (diluizione 1:1.000).
NOTA: Si può utilizzare un rapporto di diluizione più basso, cioè 1:500. Questo riduce il tempo di sviluppo delle pellicole magnetiche. - Fai crescere le pellicole a 23 °C in condizioni statiche per tre giorni. Non muovere le pellicole durante questo periodo, poiché potrebbe influire sulla morfologia superficiale finale della pellicola.
- Scatta foto con un binocolo ed esposizione omogenea ai fulmini. In alternativa, scatta una foto delle pellicole con una fotocamera ad alta risoluzione. Per evitare artefatti causati da angoli di luce e ombre incoerenti, scatta foto dall'alto con la fotocamera fissata su un treppiede e usa una sorgente luminosa morbida e ampia a 45° da entrambi i lati.
NOTA: Un metodo alternativo per studiare la multicellularità di B. subtilis è il test a colonia di biofilm su un mezzo MSgg solido che induce biofilm. Come le pellicoli, questo saggio consente lo studio dei processi spaziotemporali. Una volta determinata la gamma attiva degli inibitori di piccole molecole, il loro effetto sulla formazione delle colonie di biofilm può essere studiato. - Per coltivare colonie di biofilm, si punteggia simmetricamente 1,5 μl della pre-coltura non lavata (Passo 1.7) sulla piastra di agar MSgg essiccata all'1,5% con l'aiuto di un modello — 4 gocce per piastra di Petri di 8,5 cm di diametro. Lascia che le gocce si assorbano sulla piastra prima di spostarle.
NOTA: Il modello aiuta a ottenere una distribuzione uniforme delle colonie di biofilm nell'area in cui le cellule sono cresciute. Per preparare il modello, disegna l'area totale di crescita alle scale originali, dividila in settori uguali e segna il centro. Per una piastra di Petri rotonda di 8,5 cm di diametro, questo assegna 14cm 2 a una colonia di biofilm. - Incubare le placche a 30 °C per tre giorni. Durante questo periodo, le colonie di biofilm si sviluppano e formano una struttura tridimensionale e rugosa.
- Fai foto come nel passo 1.11.
Tabella 1. Ultima composizione MSgg 1x utilizzata in questo studio.
| 1,925 mM | Monobasico fosfato di potassio |
| 3,075 mM | Dibase fosfato di potassio |
| 100 mM | 3-(N-morfolino)acido propanosolfonico, pH 7,1 |
| 2 mM | Cloruro di magnesio esaidrato |
| 700 μM | Cloruro di calcio anidro |
| 50 μMa | Cloruro di ferro(III) esaidrato |
| 125μM b |
| 1 μM | Cloruro di zinco anidro |
| 2 μM | Cloridrato di tiamina |
| 50 μg/ml | Triptofano |
| 50 μg/ml | Fenilalanina |
| 50 μg/ml | Treonina |
| 0,5% (v/v) | Glicerolo anidro |
| 0,5% (a testa/v) | L-glutamamico acido salare monosodio idrato |
| aper il saggio pellicolare; bper il saggio biofilm |
