Test sulla resistenza all'etanolo per valutare l'integrità della matrice del biofilm

Abstract

Fonte: Bucher, T., et al. Metodologie per lo studio dei biofilm di B. subtilis come modello per caratterizzare inibitori di biofilm di piccole molecole. J. Vis. Esp. (2016).

Questo video dimostra come l'integrità della matrice dei biofilm influenzi la resistenza batterica all'etanolo confrontando le unità formative di colonie in biofilm non trattati e interrotti da inibitori. La riduzione delle CFU nei campioni trattati con inibitori dimostra che la matrice extracellulare è essenziale per proteggere le cellule incorporate nel biofilm dallo stress antimicrobico.

Protocollo

1. Saggio di resistenza all'etanolo

1. Coltivare biofilm e, dopo 68 ore di crescita a 30 °C, tagliare le colonie di biofilm in due parti uguali con l'aiuto di una lametta e del modello.
2. Sollevare con cura ogni metà della colonia di biofilm dalla piastra di agar con una piccola spatola e spostarla in un tubo microcentrifuga da 1,5 ml contenente 500 μl di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS). Se necessario, raschiare le cellule rimanenti dalla piastra e trasferirle anche nel tubo della microcentrifuga.
   NOTA: La seconda metà della colonia di biofilm viene trattata in modo differente, a seconda che si tratti del controllo o di testare la resistenza agli agenti sterilizzanti.
3. Per il controllo, incubare la seconda metà della colonia di biofilm in PBS da 500 μl. Per valutare la resistenza agli agenti sterilizzanti, trasferire la seconda metà della colonia di biofilm a etanolo da 500 μl al 50% (v/v).
   NOTA: Possono essere utilizzati agenti sterilizzanti alternativi come l'ipoclorito di sodio. Per tutti gli agenti sterilizzanti utilizzati, si determina la concentrazione attiva e il tempo di incubazione in un esperimento preliminare.
4. Incubare le colonie di biofilm per 10 minuti sul piano a temperatura ambiente.
5. Centrifugare le colonie di biofilm per 5 minuti a 18.000 x g e rimuovere con cura il surnatante con una pipetta. Aggiungi 300 μl di PBS.
6. Sonica le cellule leggermente (ampiezza 10%, impulso di 5 secondi) con la micropunta di un sonicatore.
   NOTA: L'energia di sonicazione deve essere sufficiente a separare gli aggregati di biofilm. Tuttavia, una sonicazione troppo aggressiva può lisare le cellule. Confermare in anticipo tramite microscopia luce che l'energia di sonicazione utilizzata non lisa le cellule e che tutti gli aggregati siano sciolti.
7. Aggiungi 700 μl di PBS a un volume finale di 1 ml. Eseguire una diluizione seriale (fino a ^10-7) in PBS e spargere 100 μl di 3 diluizioni su una piastra di agar LB-1,5% usando perle di vetro sterili.
   NOTA: Le diluizioni ottimali da impiattare dovrebbero essere determinate in un esperimento preliminare, poiché dipendono dalla quantità di cellule nella colonia di biofilm di interesse e dal tasso di sopravvivenza delle cellule in risposta all'agente sterilizzante.
8. Incubare le placche durante la notte a 30 °C, contare la CFU e determinare la CFU/ml. Dal CFU/ml finale di ciascuna delle semicolonie di biofilm, si calcola la percentuale di sopravvissuti.
   NOTA: Quando eseguita e analizzata come descritto, le due metà della colonia di biofilm di controllo e la metà non trattata rispetto a quella trattata con etanolo della colonia non trattata dovrebbero fornire differenze inferiori al 10% nel conteggio cellulare vitale, verificando rispettivamente la simmetria o la resistenza della colonia. In alternativa, i risultati possono essere rappresentati in CFU totale. Il numero di cellule della colonia di biofilm di controllo e non trattata dovrebbe rimanere nello stesso ordine di grandezza. Al contrario, si prevede che il conteggio cellulare della metà di una colonia di biofilm trattato con etanolo di piccole molecole diminuisca di almeno due ordini di grandezza, riportando una maggiore sensibilità all'agente sterilizzante.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Luria Broth, Lennox	Difco	240230
Bacto Agar	Difco	214010
Monobasico fosfato di potassio	Sigma, 136,09 g/mol	P0662-500G
Dibase fosfato di potassio	Fisher Scientific, 174,18 g/mol	BP363-1
3-(N-morfolino)acido propanosolfonico	Fisher Scientific, 209,27 g/mol	BP308-500
Cloruro di magnesio esaidrato	Merck, 203,30 g/mol	1.05833.0250
Cloruro di calcio anidro	J.T. Baker, 110,98 g/mol	1311-01
Cloruro di manganese(II) tetraidrato	Sigma, 197,91 g/mol	31422-250G-R
Cloruro di ferro(III) esaidrato	Sigma, 270,30 g/mes)	F2877-500G
Cloruro di zinco anidro	Acros Organics, 136,29 g/mol	424592500
Cloridrato di tiamina	Sigma, 337,27 g/mol	T1270-100G
L-triptofano	Fisher Scientific, 204,1 g/mol	BP395-100
L-fenilalanina	Sigma, 165,19 g/mol	P5482-100G
L-treonina	Sigma, 119,12 g/mol	T8625-100G
Glicerolo anidro	Bio-Lab Itd	712022300
I sali monosodici dell'acido L-glutammico idratano	Sigma, 169,11 g/mol	G1626-1KG
D-leucina	Sigma, 169,11 g/mol	855448-10G
Etanolo anidro	Gadot	830000054
Lametta di rasoio	Eddison	NA
Carte filtranti circolari per cellulosa	Whatman, 90 mm	1001-090
Glutaraldeide	EMS (Electron Micoscopy Science), 25% in acqua	16220
Paraformaldeide	EMS, 16% in acqua	15710
Cacodilato di sodio	Merck, 214,05 g/mol	8.2067
Cloruro di calcio 2-idrato	Merck, 147,02 g/mol	1172113
Shaker 37 °C	New Brunswick Scientific Innowa42	NA
Centrifuga	Centrifuga da tavolo Eppendorf 5424	NA
Sonifier digitale, modello 250, usato con microtip a doppio passo	Branson	NA
Incubatrice 30 °C	Raccoglitore	NA
Incubatrice 23 °C	Raccoglitore	NA
Sistema di filtri, 500 ml, polistirene	Cornig Incorporated	NA
Rotante Shaker - Orbitron Rotatorio II	Boekel	NA