Preparazione delle colonie di biofilm batterici per l'analisi morfologica

Abstract

Fonte: Bucher, T., et al., Metodologie per lo studio dei biofilm di B. subtilis come modello per caratterizzare inibitori di biofilm a piccole molecole. J. Vis. Esp.(2016)

Questo video dimostra la preparazione di colonie mature di biofilm batterici per l'imaging ad alta risoluzione. Comprende le fasi di fissazione, disidratazione, montaggio e rivestimento metallico per preservare e visualizzare la morfologia del biofilm.

Protocollo

Preparazione del campione di colonia di biofilm per microscopia elettronica a scansione

1. Coltiva colonie di biofilm batterici.
2. Prepara un nuovo lotto di glutaraldeide al 2% (v/v), soluzione di paraformaldeide al 3% (v/v) in 100 mM cacodilato di sodio, 5 mM di tampone cloruro di calcio, pH 7,3. Prepara 5 ml di fissativo per ogni piastra di Petri di 8,5 cm di diametro.
   ATTENZIONE: Glutaraldeide e paraformaldeide sono pericolose. Maneggiali con dispositivi di sicurezza all'interno di un cappuccio chimico. Scartare le soluzioni e i materiali contaminati nei rifiuti pericolosi.
3. Aggiungi con cura il fissativo alle colonie di biofilm, senza dispensarlo direttamente sopra i biofilm.
   NOTA: A causa del carattere idrofobo della colonia di biofilm, le colonie si staccano lentamente dall'agar e iniziano a galleggiare.
4. Sigilla con cura le lastre con una striscia di Parafilm. Incubare su uno shaker rotante per 2 ore a temperatura ambiente e successivamente trasferire le piastre a 4 °C durante la notte.
5. Il giorno seguente, rimuovere con cura il liquido con una pipetta Pasteur collegata a una pompa a vuoto.
6. Aggiungi con attenzione 10 ml di cacodilato di sodio, 5 mM di tampone di cloruro di calcio per lavare il biofilm e incubare per 5 minuti. Rimuovere delicatamente il liquido con la pipetta Pasteur in vetro dall'angolo del piatto per evitare di danneggiare il biofilm, e aggiungere una soluzione di lavaggio fresca con una pipettatura delicata. Ripeti questo passaggio una volta.
7. Per la disidratazione delle colonie di biofilm, procedere con i seguenti passaggi: 2x 5 min in_{ddH 2}O; 2x 20 min in etanolo al 30%; 2x 20 min in etanolo al 50%; 2x 20 min in etanolo al 70%; 2x 20 min in etanolo al 96%; 2x 30 min in etanolo al 100%.
   1. Aggiungi 15 ml di liquido per ogni piastra di Petri di 8,5 cm di diametro in ogni fase e rimuovi il liquido con cura dopo ogni incubazione.
8. Utilizza uno dei due metodi diversi per essiccare i campioni dall'etanolo.
   1. Per l'asciugatura all'aria con etanolo:
      1. Taglia una carta filtrante a cellulosa (diametro 9 cm) in quarti. Immergere brevemente un quarto in etanolo al 100%, poi trasferire con cura una colonia di biofilm galleggiante su di essa. Metti la carta filtrante bagnata in una piastra di Petri foderata con carta filtrante. Copri la piastra di Petri e lascia asciugare le colonie di biofilm durante la notte in una cappa chimica.
9. Rivestire un moncone di microscopia elettronica con nastro di carbone. Con l'aiuto delle pinzette, trasferisci con cura le colonie di biofilm sul mozzetto. Collega ogni colonia al tronco aggiungendo un sottile ponte di nastro di carbonio, fondamentale per l'eliminazione della carica sotto il fascio di elettroni. A questo punto, maneggiare con cura le colonie di biofilm poiché sono molto fragili. Conserva i campioni in un essiccatore per almeno 24 ore o fino all'esame.
10. Il giorno dell'esame, con il microscopio elettronico a scansione (SEM), si ripercorrono le colonie di biofilm per 2 minuti ad un angolo di 60° in un coatto sputter d'oro-palladio. Ripeti questo passaggio due volte e ruota i campioni di 120° tra un passo e l'altro. Alla fine, spruzza i campioni una volta per 3 minuti dalla parte superiore. Lo strato sottile di 20 nm di oro-palladio migliora la conducibilità e aumenta il contrasto del campione per l'imaging in microscopia elettronica a scansione.
11. Conservare i campioni in un essiccatore per evitare la reidratazione del campione fino all'imaging con un microscopio elettronico a scansione.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Glicerolo anidro	Bio-Lab Itd	712022300
Etanolo anidro	Gadot	830000054
Lametta di rasoio	Eddison	NA
Carte filtranti circolari per cellulosa	Whatman, 90 mm	1001-090
Glutaraldeide	EMS (Electron Micoscopy Science), 25% in acqua	16220
Paraformaldeide	EMS, 16% in acqua	15710
Cacodilato di sodio	Merck, 214,05 g/mol	8.2067
Cloruro di calcio 2-idrato	Merck, 147,02 g/mol	1172113
Supporto in alluminio a stub	EMS, testa scanalata	75230
Nastro adesivo al carbonio	EMS	77825-12
Shaker 37 °C	New Brunswick Scientific Innowa42	NA
Incubatrice 30 °C	Raccoglitore	NA
Incubatrice 23 °C	Raccoglitore	NA
Rotante Shaker - Orbitron Rotatorio II	Boekel	NA
S150 Sputter Coater	Edwards	NA
Microscopio elettronico a scansione ambientale	XL30 ESEM FEG Philips (FEI)	NA