Un metodo di coverglass a camera per la formazione in vitro di biofilm batterico

Abstract

Fonte: Beaudoin, T., et al. Visualizzazione degli effetti dell'expectorone sullo sviluppo del biofilm utilizzando un modello a coverglass camerato. J. Vis. Esp. (2016)

Questo video dimostra l'uso di un coverglass a camera per studiare l'effetto dei fattori dell'espettorato derivati dal paziente sul sviluppo del biofilm batterico.

Protocollo

Tutte le procedure relative alla raccolta dei campioni sono state eseguite in conformità con le linee guida IRB dell'istituto.

1. Metodo del vetro di copertura a camera per la formazione di biofilm
   1. Coltivare l'isolato batterico di interesse durante la notte nel substrato desiderato a 37 °C con scuotimento (200 rpm).
      NOTA: Sono stati utilizzati diversi batteri, tra cui gli isolati clinici Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, complesso Burkholderia cepacia e Achromobacter xylosoxidans. La scelta del mezzo dipende dalle varietà e dalle condizioni di interesse, tuttavia (brodo Luria) i substrati LB possono essere utilizzati per gli esperimenti iniziali.
   2. Dalla coltura notturna, si inseriscono 40 μl di coltura in 4 ml di substrato fresco e si colvono per 3-4 ore a 37 °C con agitazioni (200 RPM) per ottenere una coltura con una densità ottica a 600 nm (OD600) di circa 0,5-0,6.
   3. Diluire la coltura dal passaggio 1.2 a 1/5 nel substrato desiderato con filtrato di spettoro al 10% o senza filtrato di sputto (come controllo). Altre concentrazioni di filtrato di sputto possono essere testate (cioè 50% o 100%).
   4. Usa 200 μl di diluizione per seminare pozzi nelle camere delle vetrine.
   5. Lascia che i batteri si attacchino per 4 ore a 37 °C senza scuoti.
   6. Dopo 4 ore, rimuovi il substrato e lava delicatamente il biofilm con 1x fresco. Sostituisci con un substrato fresco da 200 μl.
      NOTA: Per studiare gli effetti dell'espettorato sul biofilm, il substrato fresco dovrebbe contenere supernatant dell'esputato.
   7. Lasciare che i biofilm crescano per il tempo desiderato a 37 °C senza scuotere, sostituendo il substrato ogni 12 ore, senza lavare fino al momento della microscopia.
      NOTA: Per studiare l'effetto dei supernatanti dell'espettorato sulla suscettibilità agli antibiotici biofilm, gli antibiotici vengono aggiunti al substrato dopo 24 ore di crescita del biofilm e vengono mantenuti nel mezzo fino alla colorazione e all'imaging dei biofilm.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Lab-Tek II Vetro di copertura camerato, borosilicato #1.5, 8 pozzi	Thermo Sicher Scientific	155409
Millers LB Broth	Thermo Fisher Scientific	12780-052	Mezzi standard per la crescita overnight/crescita di biofilm