Imaging confocale di biofilm batterici indotti da filtrati dell'expectorato in pazienti con fibrosi cistica

Abstract

Fonte: Beaudoin, T., et al. Visualizzazione degli effetti dell'expectorone sullo sviluppo del biofilm utilizzando un modello a coverglass camerato. J. Vis. Esp. (2016)

Questo video mostra un metodo in vitro per valutare come la fibrosi cistica derivata dal paziente influenzi la formazione di biofilm batterico. Utilizzando vetri da camera, colorazione fluorescente e microscopia confocale, rivela uno spessore aumentato, un'architettura alterata e una biomassa vitale più elevata nei biofilm coltivati con l'espetto, evidenziando il ruolo dei componenti dell'ospite nella modellazione dello sviluppo dei biofilm.

Protocollo

Tutte le procedure relative alla raccolta dei campioni sono state eseguite in conformità con le linee guida IRB dell'istituto.

Biofilm di colorazione e microscopia confocale

1. Seguendo il tempo di crescita desiderato (24-48 ore è il meglio), rimuovere il substrato dai pozzi della camera e lavare delicatamente ogni camera due volte con 300 μl di PBS sterile.
2. Prepara la miscela di colorazione per il biofilm mescolando 1 μl di ogni colorante (fornito nel kit di vitalità) per ogni ml di soluzione necessario. Prepara il colorante in acqua o in soluzione di substrato.

NOTA: L'acqua è raccomandata dal produttore.

3. Aggiungi 200 μl di miscela di colorante in ogni pozzo di vetro di copertura con camera e incuba a temperatura ambiente, al buio per 45 minuti.
4. Rimuovere la miscela di macchie dalle camere e lavare ogni pozzo con 300 μl di PBS sterile. Rimuovi il PBS e sostituiscilo con acqua dolce o substrato.
5. Procedere con la visualizzazione dei biofilm tramite microscopia confocale.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Lab-Tek II Vetro di copertura camerato, borosilicato #1.5, 8 pozzi	Thermo Sicher Scientific	155409
Kit di Vitalità Biofilm Vivo/Morto di Filmtracer	Thermo Fisher Scientific	L10316
Millers LB Broth	Thermo Fisher Scientific	12780-052	Supporto standard per la crescita notturna/biofilm
Soluzione salina tamponata con fosfato (Dulbecco A)	Ossassoide	BR0014G	Lavaggio delle camere di biofilm dopo la rimozione del materiale
Zeiss AxioVert 200M	Carl Zeiss