Modellazione dell'infezione intestinale nelle larve di pesce zebra utilizzando batteri alimentari

Abstract

Fonte: Flores, E., et al. Utilizzo del protozoo Paramecium caudatum come veicolo per infezioni alimentari nelle larve di pesce zebra. J. Vis. Esp. (2019).

Questo video dimostra il metodo per stabilire un modello di infezione batterica intestinale trasmessa da alimenti nelle larve di pesce zebra, nutrindole con paramecia infettata da E. coli fluorescente.

Protocollo

1. Infezione alimentare del pesce zebra
   1. Incubare i batteri con Paramecia.
      1. Prepara una co-coltura di Paramecium caudatum ed Escherichia coli MG1655 la notte precedente all'infezione. Combinare 8 mL di mezzo E3, 1 mL di una coltura paramecia in corso e 1 mL di una coltura di E. coli MG1655 (OD₆₀₀ = 1,0) risospesa in 1x E3 in fiaschette di coltura T25. Incubare le fiaschette a temperatura ambiente (RT) durante la notte. Per ogni condizione trattata, preparare due fiaschette di paramecia.
      2. Inocula il mezzo di crescita batterica (LB (Lysogeny Broth): 1 g/L di triptone, 0,5 g/L di estratto di lievito, 1 g/L di NaCl) con il ceppo infettivo dei batteri prelevando una singola colonia batterica da una piastra utilizzando un anello di inoculazione sterile. Incubare la coltura liquida a 37 °C e lasciare agitare a 110 rotazioni al minuto (rpm) durante la notte.
         NOTA: Devono essere indossati dispositivi di protezione individuale (camice da laboratorio e guanti) e dovrebbero essere utilizzati impianti di biosicurezza di livello 2 durante la gestione di agenti infettivi.
      3. Il giorno successivo, misurare il diametro₆₀₀ della coltura notturna. Calcola il volume di coltura necessario per ottenere un OD600 pari a 1 quando viene risospeso in 11 mL di mezzo.
      4. Prelevare il volume di batteri tramite centrifugazione a 6.000 g per 5 minuti, un volume per ogni fiaschetta di paramecia. Scartare il surnatante e risospendere il pellet batterico in 1 mL di mezzo E3.
      5. Opzionalmente, pre-tingi i batteri con un colorante fluorescente.
         1. Aggiungi 1 μL di colorazione batterica FM 4-64FX (soluzione standard da 5 mg/mL). Copri il tubo con una carta stagnola per proteggerti dal fotosbiancamento e incuba ruotando a temperatura ambiente (RT) per 15 minuti.
         2. Rimuovere il colorante in eccesso lavando con 1x E3: Granulare batteri tramite centrifugazione a 6.000 x g per 1,5 minuti, poi risospendere il pellet in 1 mL di mezzo E3. Ripeti il passaggio di lavaggio due volte.
         3. Preleva i batteri colorati tramite cntrifugazione a 6.000 x g per 5 minuti. Scartare il surnatante e risospendere il pellet batterico in 1 mL di mezzo E3.
      6. Aggiungi 1 mL della sospensione batterica a ciascuno dei due fiaschetti di paramecia fresca. Incubare a RT per 2 ore.
         NOTA: Se lavori con batteri colorati, incuba al buio a RT per 2 ore
2. Co-coltura batteri di lavaggio/paramecia
   1. Combinare il contenuto di entrambe le fiaschette di co-coltura paramecia/batteri in un tubo conico da 50 mL. Centrifuga campiona a 300 x g a 15 °C per 10 minuti. Assicurati che la centrifuga sia pre-raffreddata prima di questo passaggio.
   2. Rimuovere circa 10 mL del soprantatore E3 utilizzando una pipetta sierologica e aggiungere circa 10 mL di 1x E3 fresco al tubo conico.
      NOTA: Durante tutte le fasi di lavaggio, è essenziale essere molto rapidi nella rimozione del surnadante, poiché la paramecia inizierà a nuotare fuori dal pellet. Fai ruotare e rimuovere il surnatante da un tubo alla volta per garantire una gestione abbastanza rapida in questo passaggio ed evitare la perdita di paramecia nel soprandatante.
   3. Centrifugare i campioni tramite centrifugazione a 300 x g a 15 °C per 5 minuti. Rimuovere circa 10 mL del soprantantante E3 con una pipetta sierologica e aggiungere circa 10 mL di E3 fresco 1x al tubo conico. Ripeti questo passaggio due volte.
   4. Centrifuga campiona a 300 x g a 15 °C per 5 minuti. Rimuovere circa 10 mL del surnatant E3, facendo attenzione a non disturbare il pellet.
   5. Risospendere il pellet nei restanti 10 mL di mezzo E3 e trasferire 500 μL della sospensione in un nuovo tubo microcentrifuga da 1,5 mL. Mettere in pellet i 500 μL di paramecia centrifugando a 300 x g per 5 minuti per contare il numero di paramecia.
   6. Rimuovere 400 μL del soprannatante E3 dal campione da 500 μL. Aggiungere 20 μL di soluzione di formaldeide al 36,5% ai restanti 100 μL di paramecia e risospendere delicatamente, incubando per 5 minuti a 22 °C.
      NOTA: Questo passaggio elimina la paramecia per permettere il conteggio.
   7. Misura il volume totale effettivo usando la pipetta e registra. Diluire la sospensione di paramecia 1:1 v/v con una soluzione blu di tripano allo 0,4%.
   8. Usa un contatore cellulare o un emocitometro per contare il numero di paramecia morti/mL.
      NOTA: A causa della fase di fissazione precedente, la maggior parte delle paramecia sarà morta a questo punto, ma questo numero riflette il numero di paramecia vive per l'esperimento di co-incubazione. Gli autori non hanno riscontrato una morte significativa di paramecia dovuta alla co-incubazione batterica, quindi questo può essere ignorato come fattore qui.
3. Co-incubare le larve di Paramecia e zebra
   1. Calcola la concentrazione di paramecia nel tubo conico da 50 mL
   2. Calcola il volume di paramecia lavata necessario per una concentrazione di 2 x 10⁵ paramecia/mL in un volume finale di 3 mL di E3.
      NOTA: La concentrazione di paramecia può essere regolata in base al dosaggio batterico desiderato, che è soggetto a ottimizzazione.
   3. Anestesiare i pesci zebra aggiungendo tricaina in 100 mM di pH Tris 8,0 fino a una concentrazione finale di 100 mg/L. Trasferire 10 pesci zebra in ciascun pozzo di una piastra a 6 pozzi per un volume totale di 3 mL di E3 fresco contenente la giusta concentrazione di paramecia. Assicurati che le larve vengano trasferite in una quantità minima di liquido per garantire che si riprendano bene dall'anestesia nel ricevente.
   4. Incubare a 30 °C per 2 ore in un incubatore diurno in condizioni di luce diurna, per garantire condizioni di illuminazione ottimali per la preda.
   5. Lavare il pesce zebra almeno 5 volte trasferendo i pesci in un nuovo pozzo contenente 3 mL di E3 fresco contenente 100 mg/L di tricaina ogni volta.
      NOTA: Non tentare di omettere la tricaina durante il lavaggio. Il trasferimento di larve mobili senza anestesia aumenta il rischio di danni e disagio per l'animale.
   6. Opzionalmente, prepara il pesce zebra per l'imaging immergendo il pesce zebra in 3 mL di agarosio a basso scioglimento all'1% in una piastra a 6 pozzi a parete nera: l'agarosio a basso fuso è preparato in 1xE3 e riscaldato in un microonde. Una volta fusa, aggiungere tricaina a una concentrazione finale di 160 mg/mL. Posiziona i pesci sotto uno stereomicroscopio, usando una punta di caricamento gel tagliata, assicurandoti che la testa sia a sinistra e la coda a destra (Figura 1). Aspettare 5 minuti che l'agarosio si stabilisce, poi sovrapporre il pesce incorporato con 1x E3 contenente 160 mg/mL di tricaina per l'imaging.

Risultati

Figura 1: Colonizzazione del pesce zebra con batteri. I pesci zebra a 5 dpf sono stati lasciati non infetti (A) o colonizzati con mCherry che esprime (B) E. coli o (C) Salmonella...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Paramecium caudatum, vivo	Carolina	131554	No, non conservare le colture coltivabili sotto la temperatura ambiente
Soluzione blu di tripano allo 0,4%	Sigma	T8154-20ML	liquido, filtrato sterile, adatto alla coltura cellulare; Preparati con cloruro di sodio allo 0,81% e fosfato di potassio, dibasico allo 0,06%
Dimetilsolossido (DMSO)	Sigma	276855-100ML	conserva in un armadietto di sicurezza per solventi
Escherichia coli, MG1655	ATCC	ATCC 700926	può essere sostituito da qualsiasi altro ceppo di E. coli non patogeno
Tinta FM 4-64FX	Thermo Fisher	F34653	Aliquot e Negozio Congelati
Formaldeide	Sigma	F8775-4X25ML
LB Broth	Sigma	L3397-1KG
Compresse saline tamponate con fosfato	Thermo Fisher	18912014
Tetraciclina	Sigma	87128-25G	tossico, irritante
Tricaina (etil 3-aminobenzoato metanesulfonato)	Sigma	E10521-10G
Triton X-100	Sigma	X100-100ML
Soluzione Trippan Blue, 0,4%	Sigma	93595-50ML
Agarosio a basso punto di fusione UltraPure	Thermo Fisher	16520050
Emocitometro o contatore cellulare	qualsiasi
Stereomicroscopio	qualsiasi
Centrifuga da tavolo
Microonde
Ruota rotatrice
Incubatore riscaldato a scuotimento
Strutture acquatiche
Vasche di riproduzione