Sviluppo di un biofilm monostrato batterico utilizzando un reattore elettrochimico

Abstract

Fonte: Tokunou, Y. et al., Rilevamento elettrochimico dell'effetto isotopico cinetico del deuterio sul trasporto extracellulare degli elettroni in Shewanella oneidensis MR-1. J. Vis. Esp. (2018)

Questo video dimostra l'assemblaggio e il funzionamento di un modello di reattore elettrochimico progettato per simulare la formazione di biofilm su superfici di elettrodi. La stimolazione elettrochimica controllata favorisce l'adesione microbica, portando allo sviluppo graduale di un biofilm monostrato batterico.

Protocollo

1. Costruzione di un reattore elettrochimico a tre elettrodi (Figura 1)
   1. Inserisci un substrato di ossido dopata con indio stagno (ITO) come elettrodo di lavoro sul fondo del reattore.
   2. Successivamente, inserire un cilindro di vetro (diametro di 2 cm) e un coperchio in politetrafluoroetilene (PTFE). Poi inserire cloruro d'argento/argento (Ag/AgCl) (cloruro di potassio, saturo di KCl) e un filo di platino nel reattore come elettrodo di riferimento e contro-elettrodo, rispettivamente.
      NOTA: Per evitare perdite di aria e soluzione, inserire un foglio di gomma butilica tra ogni componente.
   3. Aggiungere 4,0 mL di mezzo definito (DM) integrato con 10 mM di lattato e 0,5 g/L di estratto di lievito nel reattore elettrochimico.
   4. Dopo aver verificato che non ci sono perdite dal reattore elettrochimico, si fa fluire il gas azoto nel reattore elettrochimico per 20 minuti per mantenere condizioni anaerobiche all'interno del reattore elettrochimico.
      NOTA: Per prevenire la contaminazione da altri microrganismi, il gas dovrebbe essere filtrato prima di entrare nel reattore elettrochimico.
   5. Collegare il reattore elettrochimico a un potenziostato e applicare +0,4 V (rispetto all'elettrodo a idrogeno standard, SHE) all'elettrodo ITO, mantenendo la temperatura del reattore elettrochimico a 30 °C tramite un sistema di circolazione dell'acqua esterno.
      NOTA: Per prevenire l'effetto di un campo elettrico esterno, il reattore elettrochimico dovrebbe essere inserito in una gabbia di Faraday.
2. Coltivazione elettrochimica delle cellule MR-1 di S. oneidensis (Figura 1 e Figura 2)
   1. Regolare la densità cellulare della sospensione ottenuta al passo 1.1 a una densità ottica di 1,43 a 600 nm (OD₆₀₀) con DM integrato da 10 mM di lattato e 0,5 g/L estratto di lievito.
      NOTA: Per ottenere il corretto OD₆₀₀, applicare la sospensione cellulare di OD₆₀₀ ≤ 0,8 a uno spettrometro UV-vis prima di regolare OD₆₀₀ a 1,43.
   2. Aggiungere 0,3 mL della sospensione della cella nel reattore elettrochimico tramite la porta di iniezione usando una siringa: il diametro OD₆₀₀ nel reattore passa a 0,1.
      NOTA: L'aggiunta di sospensioni a celle da 0,3 mL con diametro_{diametrale 600} = 1,43 in un reattore elettrochimico contenente un mezzo di 4,0 mL produce 4,3 mL di soluzione con diametro_{diametrale 600} = 0,1. Quando si utilizzano altri reattori con volumi diversi, è necessario calcolare la densità della cella.
   3. Continuare l'applicazione potenziale a +0,4 V (rispetto al SHE) all'elettrodo ITO per 25 ore.
      NOTA: Per la formazione di un biofilm monostrato su un elettrodo ITO, assicurarsi che la corrente prodotta mostri una deviazione inferiore al 50% dalla Figura 2.

Risultati

Figura 1: Reattore elettrochimico utilizzato in questo studio. Fotografia della cella elettrochimica prima della costruzione (a) e dopo la costruzione (b). (c) Illustrazione schematica del reattore elettrochimico dopo 25 ore di inoculazione elettrochimi...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Cilindro di vetro	N/A	N/A	Su misura, utilizzato come reattore elettrochimico
Rivestimento e base in PTFE	N/A	N/A	Realizzati su misura, utilizzati come copertura e base del reattore elettrochimico
Gomma butilica	N/A	N/A	Realizzati su misura, inseriti tra ogni componente del reattore elettrochimico
Septa	GL Science	3007-16101	Utilizzato come porta di iniezione di reattori elettrochimici
Elettrodo con ossido dopata con stagno (ITO)	GEOMATEC	N.0001	Utilizzato come elettrodo di lavoro, 5Ω/sq
Elettrodo saturo KCl Ag/AgCl	HOKUTO DENKO	HX-R5	Utilizzato come elettrodo di riferimento, Φ0,30mm
Filo di platino	La Cooperazione Nilaco	PT-351325	Utilizzato come contro-elettrodo
Luria-Bertani (LB) Broth, Miller	Becton, Dichkinson and Company	244620	Mezzo per la precoltivazione di S. oneidensis MR-1
Bacto agar	Becton, Dichkinson and Company	214010
NaHCO₃	Wako	191-01305	Utilizzato per un mezzo definito (DM)
CaCl₂·2H₂O	Wako	031-00435	Usato per DM
NH₄Cl	Wako	011-03015	Usato per DM
MgCl₂·6H₂O	Wako	135-00165	Usato per DM
NaCl	Wako	191-01665	Usato per DM
2-[4-(2-idrossietil)-1-piperazinil] acido etanosulfonico (HEPES)	DOJINDO	346-08235	Usato per DM
Soluzione di lattato di sodio	Wako	195-02305
Estratto di lievito bacto	Becton, Dichkinson and Company	212750
Ossido di deuterio (D, 99,9%)	Cambridge Isotope Laboratories, Inc.	DLM-4-PK	Additivo per esperimenti di effetto isotopico cinetico
Incubatore	TOKYO RIKAKIKAI CO. LTD.	LTI-601SD	Utilizzato per la precoltivazione
Shaker	TAITEC	NR-3	Utilizzato per la precoltivazione
Macchina autoclave	TOMY SEIKO CO. LTD.	LSX-500	Utilizzato per la sterilizzazione del reattore elettrochimico e del mezzo
Panca pulita	SANYO	MCV-91BNF	Utilizzato per prevenire la contaminazione del reattore elettrochimico e del mezzo con altri microbi
Separatore centrifuga	Eppendorf	5430R	È richiesta una velocità di rotazione fino a 6000×g
Generatore di gas azoto	Puequ CO. LTD.	PNTN-2	Al posto del generatore di gas a gas si può usare anche una bombola di gas nitrogenata
Spettrometro UV-vis	SHIMADZU	UV-1800	Utilizzato per l'ottimizzazione della densità cellulare
Potenziostato	BioLogic	VMP3	Utilizzato per la formazione di biofilm e esperimenti sull'effetto isotopico cinetico
Circolatore di acqua termale	COME UNO	TR-1A	Utilizzato per il mantenimento della temperatura di reattori elettrochimici
Gabbia di Faraday	HOKUTO DENKO	HS-201S	Utilizzato per esperimenti elettrochimici