1. Osservazione della localizzazione di SKN-1 in risposta all'infezione da Streptococcus gordonii <ol><li>Aggiungere ~100 larve L4 a ciascun estratto di lievito Todd–Hewitt (THY) seminato con Streptococcus e a ogni piastra agar del mezzo di crescita nematode (NGM) seminata con Escherichia coli (E. coli). Usa tre piastre per ceppo di batteri. Incubare le piastre per 2-3 ore a 25 °C.</li><li>Successivamente, rimuovere le piastre dall'incubatrice, lavarle con un tampone M9 modificato (M9W) e raccogliere i vermi in tubi conici da 15 mL.</li><li>Lava i vermi 3 volte.</li><li>Rimuovere la maggior parte del M9W tramite aspirazione e aggiungere 500 μL di M9W contenente 2 mM di azido di sodio o 2 mM di cloridrato di tetramisolo al pellet di vermi. Questo anestesierà i vermi, assicurando che non si muovano durante l'osservazione al microscopio. ATTENZIONE: Utilizzare dispositivi di protezione individuale (DPI) quando si maneggia azide di sodio. Prepara la soluzione azide sotto un cappuccio chimico.</li><li>Incubare i pellet di verme a temperatura ambiente (RT) per 15 minuti. Poi, si puntano 15 μL della sospensione a vermi su un tampone di agarosio preparato. Posiziona delicatamente un copricapo n. 1.5 sopra il cuscinetto di agarosio contenente i vermi anestetizzati.</li><li>Utilizzando un microscopio fluorescente, visualizza la localizzazione del fattore di trascrizione 1 della famiglia Skinhead, o SKN-1:GFP (SKN-1 marcato con proteina fluorescente verde), utilizzando filtri fluoresceina isotiocianato (FITC) e 4′,6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI). Vermi immagine a ingrandimenti 10x e 20x.</li><li>Punteggio dei vermi in base al livello di localizzazione di SKN-1. Nessuna localizzazione nucleare, la localizzazione di SKN-1B/C::GFP (ISOFORMA B/C marcata con proteina fluorescente verde) nella parte anteriore o posteriore del verme, e la localizzazione nucleare di SKN-1B/C::GFP in tutte le cellule intestinali sono classificate rispettivamente come bassi, medi e alti livelli di localizzazione.</li><li>Dopo aver valutato le micrografie fluorescenti, determinare le differenze statistiche tramite chi-quadrato e test esatti di Fisher utilizzando software statistico.</li></ol>

<table class='ck-table-resized'><tbody><tr><td>Mezzi e sostanze chimiche</td><td> </td><td> </td><td> </td></tr><tr><td>BD Bacto brodo Todd Hewitt</td><td>Fisher Scientific</td><td>DF0492-17-6</td><td> </td></tr><tr><td>Tubi centrifugatori sterili conici in polipropilene da 15 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-565-269</td><td> </td></tr><tr><td>Azida di sodio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S2002-25G</td><td> </td></tr><tr><td>Tetramisole cloridrato</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L9756</td><td> </td></tr><tr><td>Scorrimenti di copertura n. 1.5 18 mm x 18 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-541A</td><td> </td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9539-50G</td><td> </td></tr><tr><td>LD002</td><td>IdIs1</td><td>SKN-1B/C::GFP + rol-6(su1006)</td><td>Keith Blackwell</td></tr></tbody></table>

visualizzazione dello stress ossidativo indotto da patogeni in c. elegans utilizzando skn-1 marcato con gfp

Fonte: <a href='https://app.jove.com/v/59301/studying-oxidative-stress-caused-mitis-group-streptococci'>Naji, A., et al. Studio dello stress ossidativo causato dagli streptococchi del gruppo Mitis in Caenorhabditis elegans. J. Vis. Esp. (2019)</a>Questo video dimostra l'uso di SKN-1 con proteine fluorescenti verdi in C. elegans per monitorare lo stress ossidativo monitorando la fluorescenza verde. I vermi esposti a S. gordonii mostrano una forte fluorescenza nucleare, confermando lo stress indotto dal patogeno, mentre quelli alimentati da E. coli mostrano fluorescenza verde diffusa nel citoplasma, indicando una minima attivazione di SKN-1.

Visualizzazione dello stress ossidativo indotto da patogeni in C. elegans utilizzando SKN-1 marcato con GFP

Source: Naji, A., et al. Studying Oxidative Stress Caused by the Mitis Group Streptococci in Caenorhabditis elegans. J. Vis. Exp. (2019)This video ...

https://cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/24504/24504_article_thumb_24504.jpg

Si inizia con due piastre contenenti vermi C. elegans che esprimono SKN-1 con proteine fluorescenti verdi, un fattore di trascrizione localizzato nel citoplasma intestinale. Questi vermi contengono anche granuli di lipofuscina intestinale che mostrano autofluorescenza.Una piastra è seminata con batteri non patogeni come gruppo di controllo, l'altra con batteri patogeni come gruppo di test.Nel gruppo di prova, il perossido di idrogeno prodotto dal patogeno induce stress ossidativo, scatenando la traslocazione di SKN-1 nei nuclei intestinali.Nel gruppo di controllo, la maggior parte di SKN-1 rimane diffusamente distribuita nel citoplasma.Lava ogni piastra con un tampone e trasferisci i vermi nei tubi.Centrifuga per separare i lombrini e rimuovere il tampon.Aggiungi un mezzo contenente azida di sodio per anestetizzarli.Montare i vermi su cuscinetti di agarosio, posizionare le coperture e osservare al microscopio a fluorescenza. Usa l'autofluorescenza per visualizzare i confini nucleari.Un forte segnale nucleare SKN-1 nel test, rispetto al segnale citoplasmatico diffuso nei controlli, indica la rilocalizzazione nucleare e conferma lo stress ossidativo indotto dal patogeno.Utilizzando una pipetta, aggiungi circa 100 larve L4 a ciascuna piastra con semi di THY streptococcus e con E. coli con NGM. Usa tre piastre per ceppo di batteri.Incubare le placche per 2-3 ore a 25 gradi Celsius. Successivamente, rimuovere le piastre dall'incubatore. Lavali con M9W e raccogli i vermi in tubi conici da 15 millilitri.Lava i vermi tre volte rispetto a quanto fatto in precedenza nella fase centrifuga. Rimuovi la maggior parte dell'M9W tramite aspirazione. E aggiungere 500 microlitri di M9W contenenti 2 millimolari azide di sodio o cloridrato tetramisole al pellet per l'anestesia.Incuba il tubo con pellet di vermi a temperatura ambiente per 15 minuti. Poi, immergi 15 microlitri della sospensione a vermi su un tampone di agarosio preparato. Al microscopio fluorescente, visualizza la localizzazione di SKN-1 utilizzando filtri FITC e DAPI.Vermi immagine a ingrandimenti di 10 volte e 20 volte. Puntua i worm in base a tre livelli di localizzazione; bassa localizzazione, dove non si osserva localizzazione nucleare, localizzazione media, con SKN-1 BCGFP nella parte anteriore o posteriore del verme, e alta localizzazione, dove la localizzazione nucleare di SKN-1 BCGFP è osservata in tutte le cellule intestinali.

visualizing-pathogen-induced-oxidative-stress-c-elegans-using-gfp

Research

JoVE Encyclopedia of Experiments

Microbiology

Bacterial Pathogenesis and Host Interactions

bacterial-pathogenesis-and-host-interactions

Bacterial Virulence & Biofilms

Visualizing Pathogen-Induced Oxidative Stress in C. elegans Using GFP-Tagged SKN-1

71 Views. Si inizia con due piastre contenenti vermi C. elegans che esprimono SKN-1 con proteine fluorescenti verdi, un fattore di trascrizione localizzato nel citoplasma intestinale. Questi vermi contengono anche granuli di lipofuscina intestinale che mostrano autofluorescenza.Una piastra è seminata con batteri non patogeni come gruppo di controllo, l'altra con batteri patogeni come gruppo di test.Nel gruppo di prova, il perossido di idrogeno prodotto dal patogeno induce stress o...

Visualizzazione dello stress ossidativo indotto da patogeni in C. elegans utilizzando SKN-1 marcato con GFP

In This Article

Abstract

Protocol

Materials

Reprints and Permissions

Tags

Related Articles

Name	Company	Catalog Number	Comments
Mezzi e sostanze chimiche
BD Bacto brodo Todd Hewitt	Fisher Scientific	DF0492-17-6
Tubi centrifugatori sterili conici in polipropilene da 15 mL	Fisher Scientific	12-565-269
Azida di sodio	Sigma Aldrich	S2002-25G
Tetramisole cloridrato	Sigma Aldrich	L9756
Scorrimenti di copertura n. 1.5 18 mm x 18 mm	Fisher Scientific	12-541A
Agarose	Sigma Aldrich	A9539-50G
LD002	IdIs1	SKN-1B/C::GFP + rol-6(su1006)	Keith Blackwell