Visualizzazione dello stress ossidativo indotto da patogeni in C. elegans utilizzando SKN-1 marcato con GFP

Abstract

Fonte: Naji, A., et al. Studio dello stress ossidativo causato dagli streptococchi del gruppo Mitis in Caenorhabditis elegans. J. Vis. Esp. (2019)

Questo video dimostra l'uso di SKN-1 con proteine fluorescenti verdi in C. elegans per monitorare lo stress ossidativo monitorando la fluorescenza verde. I vermi esposti a S. gordonii mostrano una forte fluorescenza nucleare, confermando lo stress indotto dal patogeno, mentre quelli alimentati da E. coli mostrano fluorescenza verde diffusa nel citoplasma, indicando una minima attivazione di SKN-1.

Protocollo

1. Osservazione della localizzazione di SKN-1 in risposta all'infezione da Streptococcus gordonii

1. Aggiungere ~100 larve L4 a ciascun estratto di lievito Todd–Hewitt (THY) seminato con Streptococcus e a ogni piastra agar del mezzo di crescita nematode (NGM) seminata con Escherichia coli (E. coli). Usa tre piastre per ceppo di batteri. Incubare le piastre per 2-3 ore a 25 °C.
2. Successivamente, rimuovere le piastre dall'incubatrice, lavarle con un tampone M9 modificato (M9W) e raccogliere i vermi in tubi conici da 15 mL.
3. Lava i vermi 3 volte.
4. Rimuovere la maggior parte del M9W tramite aspirazione e aggiungere 500 μL di M9W contenente 2 mM di azido di sodio o 2 mM di cloridrato di tetramisolo al pellet di vermi. Questo anestesierà i vermi, assicurando che non si muovano durante l'osservazione al microscopio.
   ATTENZIONE: Utilizzare dispositivi di protezione individuale (DPI) quando si maneggia azide di sodio. Prepara la soluzione azide sotto un cappuccio chimico.
5. Incubare i pellet di verme a temperatura ambiente (RT) per 15 minuti. Poi, si puntano 15 μL della sospensione a vermi su un tampone di agarosio preparato. Posiziona delicatamente un copricapo n. 1.5 sopra il cuscinetto di agarosio contenente i vermi anestetizzati.
6. Utilizzando un microscopio fluorescente, visualizza la localizzazione del fattore di trascrizione 1 della famiglia Skinhead, o SKN-1:GFP (SKN-1 marcato con proteina fluorescente verde), utilizzando filtri fluoresceina isotiocianato (FITC) e 4′,6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI). Vermi immagine a ingrandimenti 10x e 20x.
7. Punteggio dei vermi in base al livello di localizzazione di SKN-1. Nessuna localizzazione nucleare, la localizzazione di SKN-1B/C::GFP (ISOFORMA B/C marcata con proteina fluorescente verde) nella parte anteriore o posteriore del verme, e la localizzazione nucleare di SKN-1B/C::GFP in tutte le cellule intestinali sono classificate rispettivamente come bassi, medi e alti livelli di localizzazione.
8. Dopo aver valutato le micrografie fluorescenti, determinare le differenze statistiche tramite chi-quadrato e test esatti di Fisher utilizzando software statistico.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Mezzi e sostanze chimiche
BD Bacto brodo Todd Hewitt	Fisher Scientific	DF0492-17-6
Tubi centrifugatori sterili conici in polipropilene da 15 mL	Fisher Scientific	12-565-269
Azida di sodio	Sigma Aldrich	S2002-25G
Tetramisole cloridrato	Sigma Aldrich	L9756
Scorrimenti di copertura n. 1.5 18 mm x 18 mm	Fisher Scientific	12-541A
Agarose	Sigma Aldrich	A9539-50G
LD002	IdIs1	SKN-1B/C::GFP + rol-6(su1006)	Keith Blackwell