Preparazione di un modello di aspirazione orofaringea murina per stabilire infezioni batteriche ai polmoni

Abstract

Fonte: Nielsen, T. B., et al., Modello di aspirazione orofaringea murina della polmonite batterica associata al ventilatore e acquisita in ospedale. J. Vis. Esp. (2018)

Questo video mostra la procedura di invio di batteri attraverso l'orofaringe nei polmoni di un topo anestetizzato per indurre infezioni polmonari e scatenare una risposta immunitaria.

Protocollo

Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato locale istituzionale per la cura degli animali e dal comitato veterinario JoVE.

1. Inoculazione/Infezione dei topi

1. Sospendere un topo anestetizzato, appendendolo per gli incisivi superiori a un filo forte e sottile (ad esempio, filo interdentale) fissato a un oggetto fisso a un'altezza circa il doppio della lunghezza del corpo del topo (ad esempio, 20 cm) sopra la superficie operativa (ad esempio, un banco da laboratorio).
2. Tira delicatamente fuori la lingua del topo dalla bocca usando pinze sterili e smussate. Trasferisci la lingua su un dito sterile guantato per evitare schiacciamenti accidentali della lingua del topo. Tieni la lingua fuori dalla bocca, permettendo l'accesso all'orofaringe e impedendo la deglutizione dell'inoculo di lato.
3. Mentre si tiene la lingua del topo, si inserisce l'inoculo da 50 μL (sospensione batterica) nell'orofaringe usando una micropipetta; L'orofaringe si trova alla giunzione tra la cavità orale e la faringe, verso la parte posteriore della bocca.
   NOTA: È molto importante somministrare liquido solo tramite pipetto fino al primo stop della micropipetta. Il topo smetterà di respirare per alcuni secondi quando l'inoculo viene inserito nell'orofaringe; Alla fine, l'aspirazione riflessa farà sì che il topo inali la sospensione batterica, indicata dal caratteristico crepitio del liquido che entra nei polmoni, che provoca un'infezione da polmonite.
4. Se l'inoculo non è posizionato abbastanza indietro da bloccare la respirazione normale, pizzica le narinari con una pinza per forzare l'aspirazione riflessa attraverso la bocca e la successiva inalazione dell'inocolo.
5. Dopo l'inoculazione, rilascia la lingua, togli il topo dal filo di sospensione, mettilo in una gabbia e monitora finché non si sveglia dall'anestesia.

2. Monitoraggio della progressione della malattia

NOTA: A causa della sofferenza animale, dovrebbero essere usati vari indicatori per indicare quando i topi diventano moribondi; l'eutanasia dovrebbe essere effettuata dopo questa determinazione, in conformità con un protocollo IACUC precedentemente approvato; vari marcatori di moribundità includono la temperatura corporea, la perdita di peso, l'aspetto, l'andatura e altri biomarcatori che possono essere ottenuti dal sangue (ad esempio, tramite iSTAT).

1. Eutanasia i topi secondo il protocollo IACUC precedentemente approvato (ad esempio, CO₂ seguito da lussazione cervicale).
2. Rimuovere i polmoni da un topo soppresso tagliando la trachea, l'arteria polmonare e la vena polmonare vicino ai polmoni.
   1. Microscopia
      1. Inserire i polmoni (o una parte) in uno stampo per campione.
      2. Riempire lo stampo del campione con un composto per la temperatura di taglio ottimale (O.C.T.), immergendo completamente il tessuto.
      3. Congela il campione a -80 °C.
      4. Invia il campione a un laboratorio di patologia per la sezione e il montaggio su vetrine per la microscopia.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Camera per l'Anestesia	Kent Scientific Corporation	VetFlo-0720	Accoglie fino a 5 topi
Criostampo, dimensione intermedia	Sakura Tissue-Tek	4566	Stampi usa e getta per campioni in vinile, 15×15×5 mm
Filo interdentale	Oral-B	37000469537	Fissare il palo della stalla circa 6" sopra l'altezza del tavolo
Pinza	VWR	82027-440	Usato per tirare delicatamente fuori la lingua dalla bocca del topo
Isoflurano per anestesia	Abbott	10015516	Si può usare un farmaco alternativo; modificare la procedura di conseguenza
Cartuccia iSTAT	Abbott	03P79-25	Sono disponibili varie cartucce per soddisfare le tue esigenze
Ketamina, 100 mg/mL	Fornitura Medica Occidentale	4165	Diluire 1:10 in PBS a 1 mg/mL e combinare con la xilazina a 1 mg/mL
Pomata per gli occhi	Akorn	Lacrime rinnovate	Evita di toccare l'occhio con la punta del distributore
Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)	Corning	21-031-CM	PBS di Dulbecco senza calcio né magnesio
Punte per pipette, 200-μL	VWR	10017-044	Autoclave prima dell'uso
Pipetter, 200-μL	Gilson	Pipetman P200	Autoclave e calibrazione prima dell'uso
Diffusore, cellula batterica	Bel-Art	F377360006	Sterilizza tramite cottura o autoclavaggio prima di ogni utilizzo
Fiala, criogenica, 2,0 mL	Corning	430659	Utilizzato per la conservazione criogenica di inoculi batterici concentrati