Trattamento attivato dalla luce dei biofilm batterici utilizzando un precursore fotosensibilizzatore

Abstract

Fonte: Zhao, K., et al. Un modello in vitro per studiare l'effetto della terapia fotodinamica mediata da acido 5-aminolevulinico sul biofilm di Staphylococcus aureus . J. Vis. Esp. (2018)

Il video mostra un protocollo di terapia fotodinamica per valutare gli effetti antibatterici sui biofilm batterici Gram-positivi. I biofilm sono suddivisi in quattro gruppi: due ricevono un precursore del fotosenziatore e due ricevono un buffer. Tutti vengono incubati al buio, seguiti dall'esposizione alla luce rossa a un gruppo trattato con precursori e a un gruppo solo cuscinetto (buffer). Le specie reattive di ossigeno si generano solo nel gruppo che riceve sia il precursore che la luce, portando alla morte cellulare batterica. La vitalità viene confrontata tra tutti i gruppi per valutare l'efficacia del trattamento.

Protocollo

1. Formazione del biofilm

1. Formazione di biofilm in microplacche a 96 pozzi
   1. Recupera il ceppo USA300 e 3 ceppi clinici biofilm-forming (C1-C3) conservati a -80 °C.
      NOTA: La capacità dei ceppi clinici di formare biofilm è stata determinata dal saggio a microtitolazione della placca.
   2. Inoculare il batterio in un mezzo di 5 mL di brodo di soia triptone (TSB) e coltivare in incubatrice con agitazione a 37 °C durante la notte fino alla fase stazionaria.
   3. Centrifugare la coltura batterica durante la notte a 4.000 × g per 10 minuti a 25 °C e eliminare il surnadante. Risospendere i pellet in soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) a una concentrazione finale di 2,0 × 10 unità formanti di⁹ colonie (CFU)/mL.
      NOTA: La concentrazione del batterio è stata stimata misurando la densità ottica e ulteriormente determinata dal numero di placche, rivelando che 1 OD₆₀₀ di sospensione conteneva 1,5 × 10⁸ CFU/mL.
   4. Diluire la sospensione batterica a 1:200 (1,0 × 10⁷ CFU/mL) in un mezzo TSB contenente 0,5% di glucosio. Inoculare 200 μL di sospensione batterica in ciascun pozzetto di una micropiastra di polistirene trattata in coltura cellulare a 96 pozzi.
   5. Incubare la micropiastra staticamente a 37 °C per 24 ore in un ambiente ben ossigenato.
      NOTA: Il tempo di incubazione per la formazione di biofilm maturo può variare a seconda dei diversi ceppi batterici; questo dovrebbe essere determinato prima dell'esperimento di Terapia Fotodinamica (PDT).
   6. Scartare il substrato nei pozzi e lavare delicatamente i pozzi a micropiastre con PBS tre volte, poi scartare il sovrandante.
      NOTA: Il passaggio deve essere eseguito con molta delicatezza per evitare di disturbare il biofilm formato.

2. Irradiazione luminosa

1. Conserva l'acido 5-aminolevulinico (5-ALA) in un frigorifero a 4 °C. Prima dell'esperimento, diluire il 5-ALA con PBS a 10 mM.
   NOTA: la soluzione 5-ALA deve essere preparata da zero prima dell'esperimento.
2. Nel gruppo sperimentale, si aggiungono 200 μL di 10 mM di ALA in ogni pozzo della micropiastra o 2 mL nel piatto di coltura. Copri il piatto/piatto con carta stagnola e incuba per 1 ora. Successivamente, irradiare la piastra con un diodo emettente luminoso (LED) con un'intensità luminosa di 100 mW/^cm2 per 1 ora per ottenere una dose luminosa di 360 J/^cm2 a una lunghezza d'onda maggiore di 633 ± 10 nm.
   NOTA: Per permettere che l'energia luminosa venga consegnata in modo efficace ed equo al biofilm in tutti i pozzi/parabole, fissare la distanza dal picco della sorgente luminosa al pozzo/antena a 6,0 cm e limitare la regione sperimentale all'area centrale di irradiazione (10 cm × 8 cm). Per garantire che i risultati siano riproducibili, gli esperimenti dovrebbero essere eseguiti alla stessa temperatura ambiente. Nella fase di irradiazione LED, per evitare l'esposizione diretta della piastra ad altre fonti luminose, come luce solare, illuminazione della stanza o lampada, il LED veniva acceso prima di spostare la piastra o la parabola nell'area di irradiazione, e la luce era abbastanza intensa da completare l'operazione.
3. Configurare i gruppi di controllo (nel nostro esperimento erano stati organizzati tre gruppi di controllo).
   1. Per il primo gruppo di controllo (ALA-LED-), aggiungere 200 μL di PBS a ciascun pozzetto della micropiastra o 2 mL al piatto di coltura. Copri il piatto/piatto con carta stagnola e lascialo incubare per 2 ore.
   2. Per il secondo gruppo di controllo (ALA+LED-), aggiungere 200 μL di 10 mM ALA a ciascun pozzo della micropiastra o 2 mL alla piastra di coltura. Copri il piatto/piatto con carta stagnola e lascialo incubare per 2 ore.
   3. Per il terzo gruppo di controllo (ALA-LED+), aggiungere 200 μL di PBS a ciascun pozzetto della micropiastra o 2 mL al piatto di coltura. Copri il piatto/piatto con carta stagnola e incubalo per 1 ora. Poi, esponi la piastra al LED con irradiazione luminosa di 360 J/cm² a una lunghezza d'onda principale di 633 ± 10 nm.
      NOTA: Nel passaggio di irradiazione LED, evita l'esposizione diretta della piastra ad altre fonti luminose, come la luce solare, l'illuminazione della stanza o la luce della lampada.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Brodo di Soia al Triptone (TSB)	OXOIDE	CM0129B
SYTO9	Thermo Fisher Scientific	L7012	I kit di vitalità batterica LIVE/DEAD di BacLight
Propidio ioduro (PI)	Thermo Fisher Scientific	L7012	I kit di vitalità batterica LIVE/DEAD di BacLight
Acido 5-aminolevulinico (ALA)	Fudan Zhangjiang Bio-Farmaco	3.1
Ceppo Staphylococcus aureus USA300			Riferimenti USA 300
Ceppi clinici di Staphylococcus aureus (C1-C3)			Tutti i ceppi clinici sono stati isolati da pazienti con rinosinusite cronica
Micropiastra a 96 pozzi	Corning Inc	3599	Micropiastre trasparenti a base piatta in polistirolo trattato TC, avvolte singolarmente, con coperchio, sterili
Microcentrifuga Eppendorf 5417	Eppendorf	Z365998 | SIGMA
Incubatore	Thermo Fisher Scientific	SHKE4000	MaxQ 4000 Shaker Orbitali da Benchtop
Diodo a emissione luminosa (LED)	Wuhan Yage Technique Ottica ed Elettronica CO	LED-IB