Preparazione del campione e imaging di batteri marcati con fluorescenza

Abstract

Fonte: Chetrit, D., et al. Applicazione di imaging a cellule vive e tomografia crioelettronica per risolvere le caratteristiche spaziotemporali del sistema di secrezione dot/ icm di Legionella pneumophila . J. Vis. Esp. (2020).

Questo video mostra la preparazione e l'imaging di batteri patogeni marcati con fluorescenza. I cuscinetti di agarosio vengono prima preparati e posizionati all'interno di una cornice adesiva. Una sospensione di batteri geneticamente modificati che esprimono una proteina fluorescente viene applicata al pad per immobilizzare le cellule. Il telaio viene poi sigillato con un mantello e osservato al microscopio per catturare immagini a fluorescenza dei batteri.

Protocollo

NOTA: Tutte le procedure che coinvolgono la crescita, la manipolazione e l'imaging di L. pneumophila devono essere eseguite in un laboratorio di sicurezza biologica di livello 2, in conformità con le linee guida locali.

1. Inserimento di sfGFP nel cromosoma Legionella pneumophila utilizzando strategia di scambio allelico e doppia selezione (Figura 1, Figura 2)

Clonare nel vettore di sostituzione genica pSR47S11 la seguente sequenza: la sequenza a 1.000 pb a monte del sito di interesse, poi la sequenza sfGFP, infine la sequenza a 1.000 pb a valle del sito di interesse (Figura 1). La sequenza sfGFP dovrebbe essere posizionata nel frame delle estremità N-terminali o C-terminali con un linker che contiene da quattro a otto amminoacidi. Trasformare il vettore risultante in Escherichia coli DH5αλpir. Successivamente, si streak L. pneumophila (il ricevente) per colonie singole su agar di estratto di carbone e lievito (CYE) contenente 100 μg/mL di streptomicina e si fa crescere per 5 giorni a 37 °C (Figura 2).
Striscia L. pneumophila su CYE-agar-streptomicina e cresci per 2 giorni a 37 °C (zona pesante). Striatura di E. coli DH5α trasformata con plasmide helper pRK600 (helper) su agar LB contenente 25 μg/mL cloranfenicolo. Strisciare l'E. coli DH5αλpir (donatore) su agar LB contenente 50 μg/mL di kanamicina.
Eseguire accoppiamento triparentale: incubare una colonia dell'aiutante, una colonia del donatore e del ricevente sovrapponendo chiazze dei tre ceppi su una piastra AGAR CYE senza selezione e incubando per 4–8 ore a 37 °C. Come controlli negativi, incubare un mix di ceppi aiutante+ricevente e un mix di ceppi donatore+ricevente per gli stessi periodi di tempo.
Risospendere le reazioni di accoppiamento in 500 μL di_{ddH 2}O. Placca 20 μL e 50 μL delle reazioni su agar CYE contenente 100 μg/mL di streptomicina e 10 μg/mL di kanamicina e far crescere per 5 giorni a 37 °C. Strisciare quattro dei cloni risultanti su agar CYE contenente 100 μg/mL di streptomicina e coltivare per 5 giorni a 37 °C.
Strisciare 16 cloni su agar CYE contenente il 5% di saccarosio e 100 μg/mL di streptomicina e crescere per 5 giorni a 37 °C. Successivamente, si striano 32 di questi cloni su agar CYE contenente 100 μg/mL di streptomicina e su agar CYE contenente 100 μg/mL di streptomicina e 10 μg/mL di kanamicina e si crescono per 5 giorni a 37 °C.

2. Isolamento dei cloni che hanno integrato sfGFP nel cromosoma L. pneumophila

I cloni di streak sensibili alla kanamicina su placche CYE-agar-streptomicina confermano l'inserimento di sfGFP nel cromosoma tramite reazione a catena della polimerasi di colonia (PCR). Utilizzare primer complementari al gene sfGFP e alla regione cromosomica di interesse per amplificare la giunzione di inserimento.
1. Mescola 0,5 μL di ciascuna delle soluzioni di primer da 10 μM e una colonia fino a un volume finale di 12,5 μL e denatura per 10 minuti a 95 °C. Raffredda sul ghiaccio per 10 minuti, aggiungi 12,5 μL di 2x soluzione di miscelazione master PCR ed esegui un'analisi PCR.
Coltivare abbondanti chiazze delle colonie isolate su placche CYE-agar-streptomicina per 2 giorni a 37 °C. Esaminare i livelli di espressione e la stabilità delle fusioni con sfGFP tramite immunoblotting con un anticorpo anti-GFP.

3. Imaging a cellule vive di L. pneumophila con componenti Dot/Icm marcate con fluorescenze

Preparazione dei cuscinetti di agarosio
1. Prepara circa 30 mL di una soluzione di agarosio a bassa scioglienza all'1% in acqua. Fai cuocere al microonde in una fiaschetta di vetro per circa 90 secondi, facendo roteare occasionalmente, finché l'agarosio non si dissolve completamente.
2. Posiziona due vetrine^{in vetro} da 22 x 22 x 0,15 mm 3 sul bordo di una vetrina in^vetro 3 da 25 x 75 x 1,1 mm, una sopra l'altra. Impila altre due vetrine in vetro da 22 x 22 x 0,15 mm³ sull'altro bordo.
3. Pipettare circa 1 mL dell'agarosio fuso nel veglione centrale tra le due vetrine di vetro superiori, poi posizionare un'altra^lamina 3 da 25 x 75 x 1,1 mm sopra l'agarosio fuso. Cerca di evitare la formazione di bolle d'aria. Raffreddare le slide a 4 °C per 15 minuti.
4. Usando un bisturi o una lametta, taglia delicatamente il tappeto in piccoli quadrati, ~5 x 5^{mm 2}. Fissa un telaio adesivo bifronte 17 x 28 x 0,25 mm³ su una slitta in^vetro 25 x 75 x 1,1 mm 3 e posiziona diversi cuscinetti sul carrello.
Acquisizione dell'immagine
NOTA: I seguenti passaggi sono descritti per un microscopio sotto il controllo di SlideBook 6.0 e dotato di illuminatori a stato solido, fotocamera CCD monocromatica e obiettivo 100x (apertura numerica 1,4). Se necessario, utilizzare dispositivi di microscopia alternativi con configurazioni hardware e software appropriate che possano essere personalizzate in base alle impostazioni del protocollo.
1. Dissolvere una pesante chiazza di L. pneumophila in 1 mL di_{ddH 2O}, vortice e pipetta 2–3 μL della diluizione sui cuscinetti. Posiziona delicatamente un copricapo³ 50 x 24 x 0,15 mm sopra il telaio adesivo.
2. Nella finestra di cattura regola il ND a 180. Regola il binning a 2×2 e usa il canale da 488 nm per esporre il campione tra 500 e 1.000 ms. Validare la specificità del segnale di fluorescenza tramite l'imaging di L. pneumophila non marcato con gli stessi parametri (Figura 3).

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Risultati

Figura 1: Panoramica schematica della ricombinazione omologa e dello scambio allelico utilizzati per inserire sfGFP nel cromosoma L. pneumophila.(A) È stato effettuato un accoppiamento triparentale tra un c...