Stabilimento di un modello murino di infezione da Clostridium difficile

Abstract

Fonte: Winston, J. A., et al. Modello murino trattato con cefoperazone del ceppo clinicamente rilevante di Clostridium difficile R20291. J. Vis. Esp. (2016)

Questo video mostra la procedura per inoculare topi pretrattati con antibiotici con spore di Clostridium difficile per stabilire un modello murino di infezione al fine di studiare la patogenesi e le risposte dell'ospite.

Protocollo

Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato locale istituzionale per la cura degli animali e dal comitato veterinario JoVE.

1. Preparazione dell'inoculo sporico di Clostridium difficile e del gavage orale dei topi

NOTA: I topi sfidati con spore di C. difficile dovrebbero essere ospitati in una struttura per animali di Biosicurezza Livello 2.

1. Ottenere una scorta di spore di C. difficile della varietà desiderata (in questo caso, R20291) preparata e conservata a 4 °C in acqua sterile. Determina l'enumerazione di queste spore prima dell'uso.
2. In base alla concentrazione nota (spore/ml) dello stock di spore, si calcola la diluizione desiderata per ottenere 10⁵ spore per 25 μl. Assicurarsi che il volume dell'inoculo sia adeguato per inoculare tutti i topi nell'esperimento (25 μl per topo), per effettuare l'enumerazione dell'inoculo (circa 30 μl) e per tenere conto dell'errore di pipettatura.
3. Vortex lo stock originale di spore di C. difficile . Poi, si sospede nuovamente il volume calcolato (dal passaggio 1.2) della spora originale di C. difficile in acqua sterile all'interno di un tubo microcentrifuga con tappo a vite. Esegui questo in modo aerobico in una cappa a flusso laminare. Identifica questa miscela diluita come l'"inoculo delle spore".
4. Metti l'inoculo delle spore in un bagno d'acqua a 65 °C e scaldalo per 20 minuti.
   NOTA: Questo passaggio garantirà che rimangano solo spore attive di C. difficile dopo il trattamento termico.
5. All'interno della cappa a flusso laminare, si prelevano 50 μl di inoculo di spore riscaldati, si collocano in un tubo sterile per microcentrifuga e si immerge nella camera anaerobica. Usa questo campione per l'enumerazione delle spore.
6. All'interno del cappuccio a flusso laminare, carica l'inoculo sporico riscaldato rimanente in una siringa da 1 ml attaccata a un ago gavage gastrico sterile con punta a bulbo. Utilizza un passo passo manuale per garantire dosaggi ripetuti e rapidi tra i topi. Assicurati che l'ago del gavage sia riempito con l'inoculo riscaldato delle spore prima dell'uso.
   NOTA: Non è necessario un nuovo ago sterile per ogni topo. Tuttavia, se vengono somministrate varie dosi di spore di C. difficile , si raccomanda un nuovo ago di gavage per ogni dose.
   NOTA: Le spore di C. difficile sono altamente resistenti ai disinfettanti tradizionali. Pertanto, è necessario l'uso di un disinfettante sporicida, come il disinfettante sporicida #62 Perisept. Il produttore raccomanda un tempo di contatto di 2 minuti per distruggere le spore di C. difficile .
7. Svuota ogni topo con 25 μl dell'inoculo delle spore. Immobilizza delicatamente ogni topo afferrando l'animale per la pelle sciolta del collo e della schiena per immobilizzare la testa. Usando l'indice, la testa dell'animale si immobilizza ulteriormente e si allunga l'esofago. Assicurati che l'animale non vocalizzi o mostri altri segni di disagio durante la contenzione.
   NOTA: Il volume totale assegnato ai topi dalla gavaga non dovrebbe superare i 10 ml/kg di peso corporeo (0,1 ml/10 g).
8. Mantieni il topo in posizione verticale e verticale e passa delicatamente l'ago gavage sul lato della bocca. Indirizza l'ago del gavage lungo il palato e avanza lentamente il garello nell'esofago.
   NOTA: Se si incontra resistenza, l'ago a gavaga potrebbe entrare nella trachea e quindi NON dovrebbe essere avanzato, ma rimosso e riposizionato immediatamente.
9. Dopo che l'ago del gavage è circa a metà dell'esofago, inietta 25 μl dell'inoculo delle spore riscaldate e ritira delicatamente l'ago del gavage dall'esofago.
   NOTA: L'avanzata forzata dell'ago a gavaga può portare alla rottura dell'esofago o dello stomaco. Pertanto, se si riscontra resistenza nell'avanzare dell'ago del gavage, è meglio rimuovere e riposizionare immediatamente il gavage.
10. Riporta l'animale nella gabbia e osservalo per eventuali tossi o segni di difficoltà respiratoria, poiché ciò potrebbe indicare una somministrazione tracheale involontaria o un'aspirazione dell'inoculo delle spore riscaldate.
    NOTA: I topi sono estremamente suscettibili a C. difficile dopo il trattamento antibiotico; Pertanto, sono essenziali precauzioni per prevenire la contaminazione incrociata tra gabbie. Questo è particolarmente importante quando si gestiscono topi trattati con antibiotici ma non contestati come controlli.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Detergente disinfettante per sporiziali perisept #62	SSS Navigator	48027	Questo prodotto richiederà la diluizione come raccomandato dal produttore
Mouse C57BL/6J	Il Laboratorio Jackson	664	I topi dovrebbero avere tra 5 e 8 settimane di età
Copritore a vite microcentrifuga da 2 ml	Corning	430917