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Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato locale istituzionale per la cura degli animali e dal comitato veterinario JoVE.
- Ottenere campioni per l'enumerazione di Clostridium difficile (C. difficile)
NOTA: Prima di ottenere il contenuto di feci o cecal, pesare i tubi sterili della microcentrifuga su una bilancia analitica. Annota il peso del tubo sul lato del tubo, arrotondando a quattro decimali (ad esempio, 0,9864 g). Indica questo peso come "peso del tubo". Ogni campione raccolto dovrebbe essere posto in un tubo microcentrifuga sterile e pesato.
1. Raccolta sterile di feci di topo- Trattieni delicatamente ogni topo afferrando l'animale per la pelle molla del collo e della schiena per immobilizzare la testa. Usa il mignolo per trattenere delicatamente la coda dell'animale, esponendo così l'ano. Assicurati che l'animale non vocalizzi o mostri altri segni di disagio durante la contenzione.
- Tieni un tubo sterile e pesato per microcentrifuga direttamente sotto l'ano dell'animale. È fondamentale che il tubo non entri in contatto diretto con il mouse.
- Mentre l'animale defeca, raccogli la pallina fecale nel tubo. Tieni il tubo a temperatura ambiente fino a quando non vengono raccolti tutti i campioni fecali. Può volerci diversi minuti perché un topo defeci, rendendo necessari tentativi ripetuti di raccogliere le feci.
- Pesa i tubi contenenti feci sulla bilancia analitica. Annota il peso del tubo, arrotondando a quattro decimali (ad esempio, 1,0021 g). Indichi il peso ottenuto come "peso finale del tubo".
- Passare i campioni fecali nella camera anaerobica per l'enumerazione batterica subito dopo la raccolta delle feci.
- Enumerazione batterica di C. difficile
- Calcola il peso finale dei contenuti (feci) che saranno enumerati per C. difficile. Lo facevo sottraendo il "peso finale del tubo" dal "peso del tubo".
- Calcola una diluizione 1:10 del contenuto in soluzione salina tamponata fosfato (PBS) 1X e risospendi di conseguenza. Per i pellet fecali, usa la punta della pipetta per trasformare delicatamente il pellet in soluzione.
- Incubare anaerobicamente questi campioni risospesi a temperatura ambiente per 30 minuti, permettendo al contenuto di depositarsi.
- Effettuare diluizioni seriali per ogni campione in 1x PBS per l'enumerazione delle unità formative di colonie (CFU) per g di contenuto (feci). Esegui questo in modo anaerobico.
- Utilizzando la tecnica asettica, trasferire 100 μl di ogni diluizione seriale su piastre di agar di fruttosio cicloserina (TCCFA) taurocolato. Utilizzando uno spreader sterile a forma di L, distribuisci la diluizione applicata sul mezzo per distribuirlo uniformemente sulla piastra del prodotto. La distribuzione uniforme della diluizione è essenziale per un conteggio accurato delle colonie.
- Incubare le placche anaerobicamente per 24 ore a 37 °C. A questo punto, si enumerano le colonie di C. difficile per ottenere la CFU per g di contenuto (feci). Le colonie di C. difficile sono piatte e giallo pallido, con bordi irregolari e un aspetto vetro svernato.
NOTA: Questo protocollo può essere utilizzato per elencare C. difficile da altri contenuti gastrointestinali (GI) murini, inclusi quelli ileali e colonici. Le piastre di reazione a catena della polimerasi (PCR) possono essere utilizzate per produrre diluizioni seriali.