Saggio basato sulla fluorescenza per indagare le interazioni dei recettori dei macrofagi con gli antigeni batterici

Abstract

Fonte: Barbero, A. M., et.al. Saggi di fluorescenza per lo studio dell'interazione di Mycobacterium tuberculosis con il recettore immunitario SLAMF1. J. Vis. Esp. ( (2025)

Questo video mostra un saggio basato sulla fluorescenza per studiare l'interazione tra un recettore dei macrofagi e gli antigeni di Mycobacterium tuberculosis . Gli antigeni marcati fluorescentmente su un coperchio vengono incubati con estratti proteici di macrofagi, reticolati, marcati da anticorpi e visualizzati tramite segnali di fluorescenza sovrapposti.

Protocollo

1. Interazione tra Mycobacterium tuberculosis e SLAMF1 tramite microscopia a fluorescenza

1. Reticolazione batterio-proteina
   1. Introdurre coperture rotonde da 12 mm in piastre di coltura a 24 pozzi (1 copertura per pozzo) utilizzando pinzette chirurgiche a muso rotondo.
      NOTA: Pulisci accuratamente le coperture con il 70% di etanolo. Se desiderato, possono essere autoclavate o sterilizzate sotto luce UV per 30 minuti.
   2. Incubare il coperchio con 400 μL di 10 μg/mL di Poli-D-Lisina durante la notte a 4 °C. Copri la piastra con carta stagnola per proteggerla dalla luce.
   3. Il giorno dopo, togli il piatto dal frigorifero e lava il sottocoperta due volte con 1 mL d'acqua.
   4. Lascia asciugare la copertura.
   5. Diluire 20 μL (2 x 10⁶) di Mtb-R Ags in 180 μL di 1x PBS. Gli ultimi 200 μL sono sufficienti a coprire completamente un coprimento di copertura.
   6. Incubare il coperchio con Mtb-R Ags per 1 ora a 37 °C in un incubatore cellulare.
   7. Scartare il liquido rimanente e lavare due volte con 1mL di 1x PBS (soluzione salina tamponata con fosfato).
      NOTA: In questo passaggio, la corretta adesione di Mtb-R al coperchio può essere verificata con un microscopio a fluorescenza utilizzando i filtri corrispondenti al canale rosso.
   8. Aggiungi 400 μL di tampone bloccante (10% siero fetale bovino (FBS) in 1x soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) per 30 minuti a RT in agitazione (shaker).
   9. Lava due volte con 400 μL di tampone bloccante.
   10. Incubare con 100 μL di estratto proteico diluito in 300 μL di 1x PBS per 2 ore a RT in agitazione (shaker).
   11. Aggiungi 400 μL di formaldeide all'1% diluito in 1x PBS. Incubare per 15 minuti sotto agitazione (shaker) in RT.
   12. Aggiungi 500 μL di glicina 0,125 M diluita in acqua. Incubare per 5 minuti sotto agitazione (shaker) a RT.
   13. Lava due volte con 1 mL di 1x PBS.
   14. Aggiungi 400 μL di 2 mM di glicole etilenico bis(succinimidilsuccinato) (EGS per 1 ora a RT durante agitazione (shaker).
   15. Ripeti il passo 1.1.13
       NOTA: La preparazione dei reagenti al momento dell'uso è fortemente raccomandata.
2. Colorazione SLAMF1
   1. Avvolgi il coperchio della piastra di coltura in una pellicola di paraffina.
   2. Aggiungere una goccia di 60 μL di anticorpo primario anti-SLAMF1 precedentemente titolato (diluizione 1:75) sul coperchio rivestito con film di paraffina.
   3. Rimuovere con cura la copertura dalla piastra utilizzando pinzette chirurgiche curve a punta fine e aghi.
      NOTA: Per facilitare la rimozione del copersello, l'ago può essere piegato a un angolo approssimativo di 45°.
   4. Inverti il copertino sopra la goccia contenente l'anticorpo. Incubare per 30 minuti a RT al buio.
   5. Solleva il copricapo e lava due volte con il buffer di bloccaggio.
   6. Inverti il coperto su una nuova goccia contenente l'anticorpo secondario (diluizione 1:200). Incubare per 30 minuti a RT al buio.
   7. Ripeti il passo 1.2.5.
   8. Rimuovere il liquido in eccesso e montare il copertino su una goccia di liquido di montaggio posizionata su una vetrata di vetro.
   9. Osserva al microscopio a fluorescenza utilizzando filtri adeguati.
      NOTA: Si consiglia di lavorare in condizioni sterili. Diluire gli anticorpi nel buffer bloccante. Maneggiare con attenzione la copertura per evitare graffi che potrebbero ostacolare l'osservazione al microscopio. Un fluido di montaggio adatto alla fluorescenza è altamente raccomandato.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Anticorpo secondario Alexa Fluor 488	Invitrogen	A21121	Per la microscopia a fluorescenza
Anticorpo primario anti-SLAMF1	BioLegend	306302	Per la microscopia a fluorescenza
Aqua-Poly/Mount	Poliscienze	18606-20	Supporti di montaggio
Coperture 12mm	HDA	-	Per il saggio di interazione tramite microscopia
EGS	ThermoFisher Scientific	21565	Per il trattamento della reticolazione
Formaldeide	Merck	K47740803613	Per il trattamento della reticolazione
Vetri in vetro	Glass Klass	-	Per il saggio di interazione tramite microscopia
Glicina	Sigma	G8898	Per il trattamento della reticolazione
Imager.A2	Carl Zeiss	430005-9901-000	Microscopio a fluorescenza con modulo di illuminazione Colibri 7
Poli-D-Lisina	Sigma Aldrich	A-003-M	Per il trattamento delle coperte
Rhodamine B	Sigma Aldrich	21955	Per M. Colorazione per tubercolosi