Sviluppo di un modello di infezione larvale del pesce zebra utilizzando il microgaffe

Abstract

Fonte: Li, J., et al. Sviluppo di un modello larvale di infezione da pesci zebra per Clostridioides difficile. J. Vis. Esp. (2020).

Questo video mostra la procedura del microgavage, in cui una larva di pesce zebra anestetizzata viene immobilizzata nell'agarosio e iniettata oralmente con un batterio patogeno usando un ago guidato da tracciante. Il parto non invasivo imita un'infezione naturale, permettendo di analizzare la replicazione batterica, il rilascio di tossine e il danno epiteliale intestinale.

Protocollo

1. Gavage di larve di pesci zebra

1. Calibra l'ago microgavage.
2. Misura il diametro della punta dell'ago posizionando l'ago su un vetrino di calibrazione con una goccia di olio minerale. Assicurati che la punta abbia un diametro di 30–40 μm, smussa e liscia. Scarta gli aghi appuntiti o ruvidi.
   NOTA: I bordi affilati degli aghi possono essere smussati con una fiamma rapida.
3. Prepara la soluzione del gavage.
4. Carica e monta l'ago su un micromanipolatore.
5. Regola il micromanipolatore per posizionare l'ago a un angolo di 45°.
6. Anestetizzare le larve del pesce zebra. Quando le larve smettono di muoversi, trasferirle nella scanalatura di uno stampo a microgavage usando una pipetta Pasteur.
7. Applicare una goccia di agarosio a bassa fusione dello 0,8% sulle larve del pesce zebra per coprirla. Regolare delicatamente le larve con le teste rivolte in verticale ad angoli di 45° nella scanalatura e le code contro la parete della scanalatura. Assicurati che gli angoli delle teste siano approssimativamente uguali, in modo che siano allineati con l'angolo degli aghi del gavage. Posizionare la muffa microgavage sul ghiaccio per 30–60 secondi, permettendo all'agarosio a bassa fusione di solidificarsi per stabilizzare la posizione delle larve.
8. Regolare la pressione di iniezione tra 200 e 300 hPa. Imposta il tempo di iniezione a 0,1–0,3 s per ottenere un volume di iniezione di 3–5 nL di Clostridioides difficile.
9. Muovi delicatamente l'ago attraverso l'agarosio, poi nella bocca delle larve di pesce zebra, attraverso l'esofago. Una volta che la punta dell'ago è all'interno del bulbo intestinale anteriore, premi il pedale di iniezione per liberare i batteri. Riempi il lumen dell'intestino con il volume consegnato. Non lasciare che trabocchi dall'esofago o dalla cloaca. Ritira delicatamente l'ago dalla bocca del pesce zebra.
10. Dopo il gage, salvare le larve di pesce zebra infette dall'agarosio con una punta microloader flessibile tagliando prima l'agarosio via e poi sollevando le larve. Trasferire queste larve in un mezzo sterile al 30% di Danieau. Risciacquare le larve in mezzo sterile due volte. Trasferire le larve in una piastra di Petri fresca da 10 cm. Le larve saranno mantenute fino a 11 giorni dopo la fecondazione (dpf).

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Agarose	Sigma-Aldrich	A2576	Agarosio gelificante ultra-basso
Agarosi a bassa fusione (LM)	Pronadisa	8050	Viene utilizzato nelle lastre di agarosio
Vetro capillare	Apparato di Harvard	30-0019	Aghi per iniezione
Clostridioides difficile			R20291,, una ceppa ribotipo 027, produzione TcdA+/TcdB+/CDT+
DMSO	Carl Roth GmbH	A994
FIJI	Piattaforma open-source		Elaborazione immagini
HEPES	Carl Roth GmbH	6763
Tiratore orizzontale per ago	Sutter instrument Inc	P-87
L-cisteina	Sigma-Aldrich	168149
Leica Application Suite X (LAS X)	Leica		Elaborazione immagini
Microiniettore	eppendorf	5253000017
Stampi a microiniezione	Strumenti di Scienze Adattive	TU1
Microscopio confocale Leica SP8	Leica
Rosso Fenolo	Sigma-Aldrich	P0290
Cloruro di potassio (KCl)	Carl Roth GmbH	5346
Cloruro di sodio (NaCl)	Carl Roth GmbH	9265
Taurocholato	Carl Roth GmbH	8149
Tricaine	Sigma-Aldrich	E10521
Estratto di lievito	BD Bacto	212750