Inoculare un patogeno batterico nelle foglie di Arabidopsis tramite infiltrazione nel vuoto

Abstract

Fonte: Rufián, J. S., et.al. Analisi a singola cellula dell'espressione dei geni di Pseudomonas syringae nel tessuto vegetale. J. Vis. Esp. (2022)

Questo video dimostra un metodo di infiltrazione a vuoto per introdurre un patogeno batterico nelle foglie delle piante di Arabidopsis . L'approccio utilizza una sospensione batterica preparata e impulsi a vuoto per consentire un ingresso uniforme attraverso gli stomi, causando un'infezione controllata delle foglie.

Protocollo

1. Inoculazione delle piante di Arabidopsis

NOTA: In questo studio, i ceppi Pseudomonas syringae pv. pomodoro DC3000 e P. syringae pv. furono utilizzate phaseolicola 1448A.

1. Prepara l'inoculo di P. syringae .
   1. Stira la ceppa di interesse di P. syringae da una stocca di glicerolo a −80 °C su una piastra LB (10 g/L di triptone, 5 g/L di NaCl, 5 g/L estratto di lievito e 16 g/L di agar batteriologico) integrata con gli antibiotici appropriati. Incubare a 28 °C per 40-48 ore.
      NOTA: L'uso di antibiotici è raccomandato se il ceppo di interesse porta un plasmide o un gene di resistenza genomica. Le concentrazioni di antibiotici raccomandate per P. syringae sono le seguenti: kanamicina (15 μg/mL), gentamicina (10 μg/mL), ampicillina (300 μg/mL).
   2. Raschiare la biomassa batterica e risospendere in 5 mL di 10 mM di_{MgCl 2}. Misura il diametro₆₀₀ e regola a 0,1 aggiungendo 10 mM di MgCl₂.
      NOTA: Un OD₆₀₀ di 0,1 di una coltura di P. syringae corrisponde a 5 x 10⁷ CFU·mL⁻¹.
   3. Eseguire diluizioni seriali in 10 mM di_MgCl2 per raggiungere una concentrazione finale dell'inoculo di 5 x 10⁵ CFU·mL⁻¹. Prepara 200 mL di inoculo per le piante di Arabidopsis .
   4. Subito prima dell'inoculazione, aggiungere il tensioativo Silwett L-77 a una concentrazione finale dello 0,01% per Arabidopsis. Si noti che Silwett è in parte dannoso per il tessuto di Arabidopsis .
2. Esegui infiltrazione in vuoto.
   1. Per l'infiltrazione da Arabidopsis, posizionare due bastoncini di legno a forma di X sopra il vaso (Figura 1E) e posizionare il vaso rivolto verso il basso sopra una piastra di Petri di 14 cm di diametro contenente l'inoculo da 200 mL (Figura 1F).
   2. Inserire le piante immerse nella soluzione di inoculo in una camera a vuoto (Figura 1G) e dare un impulso di 500 mbar per 30 secondi per infiltrarsi nelle foglie. Ripeti l'impulso di vuoto 2-3 volte finché la foglia non è completamente infiltrata (Figura 1H).
   3. Drenare la soluzione in eccesso di inoculo con un foglio di carta e riportare le piante nella corrispondente camera di crescita.

Risultati

Figura 1: Inoculazione batterica ed estrazione di apoplasti utilizzando piante di Arabidopsis . (A) Preparazione della pentola con la rete metallica adeguatamente fissata. (B) Seminare i semi usando...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Piatti di Petri da 140 mm			Nessun requisito speciale
Agar batteriologico	Roko
Solfato di gentamicina	Duchefa	G-0124
Monosolfato di kanamicina	Fitotecnologia	K378
MgCl₂	Merk
NaCl	Merk
Silwet L-77	Cromton Europe Ltd
Triptone	Merk
Camera a vuoto 25 cm di diametro	Kartell	554
Pompa a vuoto	GAST	DOA-P504-BN
Estratto di lievito	Merk
Ampicillina sodica	GoldBio