Imaging ad alto rendimento dell'infezione intracellulare da Brucella abortus nelle cellule epiteliali dell'ospite

Abstract

Fonte: Casanova, A., et al. Analisi basate su microscopia per lo screening ad alto rendimento dei fattori ospiti coinvolti nell'infezione da Brucella nelle cellule hela. J. Vis. Esp. (2016)

Questo video dimostra l'imaging ad alto rendimento dell'infezione da Brucella abortus nelle cellule epiteliali con knockdown STING mediato da siRNA per indagare il ruolo del DNA citosolico nella replicazione batterica intracellulare e nella risposta immunitaria innata dell'ospite.

Protocollo

1. Infezione e fissazione

1. Un giorno prima dell'infezione, inoculare la quantità determinata di cultura starter di B. abortus in un mezzo da 50 ml TSB/Km (brodo di soia triptico contenente 50 μg/ml di kanamicina) in una bottiglia da 250 ml a vitta. Sigilla la bottiglia con Parafilm e fai crescere i batteri durante la notte a 37 °C e 100 giri/min su uno shaker orbitale fino a OD₆₀₀ = 0,8-1,1.
2. Misurare il diametro_{diametro 600} della coltura batterica e preparare il mezzo infettivo diluendo la coltura batterica in DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) /10% FCS (siero fetale per vitelli) per ottenere la desiderata molteplicità di infezione (MOI).
   NOTA: Per ottenere un tasso di infezione del 5-10% nelle cellule HeLa, si utilizza un MOI di 10.000. Dovrebbe essere eseguita una curva di titolazione MOI per ciascun tipo cellulare al fine di ottenere tassi ottimali di infezione.
3. Sostituire il mezzo di trasfezione della piastra a 384 pozzi con 50 μl del mezzo infettivo utilizzando una lavatrice automatica per piastre.
4. Centrifuga la piastra da 384 pozzi a 400 x g e 4 °C per 20 minuti.
   NOTA: Questo aiuta a sincronizzare il processo di infezione.
5. Sigilla la piastra con Parafilm e incubala su una piastra di alluminio preriscaldata in un incubatore umido a 37 °C con il 5% di_CO2 per 4 ore.
6. Lavare le cellule con DMEM/10% FCS contenente 100 μg/ml di Gm (gentamicina) per inattivare i batteri extracellulari usando la lavatrice automatica per piastre (utilizzare 200 μl/lavaggio di overflow pozzo).
   NOTA: Durante un lavaggio in eccesso, la lavatrice automatica delle piastre dispensa e aspira contemporaneamente il medium.
7. Per il test di ingresso, lava le celle una seconda volta con DMEM/10% FCS contenente 100 μg/ml Gm e 100 ng/ml aTc usando la lavatrice automatica a piastre (usa 200 μl/lavaggio di overflow pozzo).
8. Sigilla la piastra con Parafilm e riportala su una piastra di alluminio preriscaldata nell'incubatore umido a 37 °C con il 5% di_CO2 per altre 40 o 4 ore, rispettivamente per il test finale e l'analisi di ingresso.
9. Per la fissazione, lavare i pozzi con PBS (soluzione salina tamponata a fosfato) utilizzando la lavatrice automatica per piastre (utilizzare lavaggio di 200 μl/overflow well).
10. Sostituire PBS con 50 μl 3,7% di paraformaldeide (PFA) in HEPES 0,2 M a pH 7,4 utilizzando la lavatrice automatica per piatti.
    NOTA: Attenzione: il PFA è tossico all'inalazione, a contatto con la pelle e se ingerito.
11. Incubare per 20 minuti a temperatura ambiente.
12. Sostituire il mezzo di fissazione con un PBS da 50 μl utilizzando la lavatrice automatica per piatti.
    NOTA: I campioni sono ora pronti per essere prelevati dal BSL3 se necessario.
    ATTENZIONE: La rimozione di qualsiasi campione da una struttura BSL3 (Livello di Biosicurezza 3) è soggetta a valutazione del rischio e validazione della procedura e dipende dalle normative applicabili per la biosicurezza.

2. Colorazione

1. Lava le cellule due volte con PBS da 50 μl.
2. Permeabilizzare le cellule in 50 μl 0,1% di Triton-X-100 in PBS per 10 minuti.
3. Lava le cellule tre volte con PBS. Aggiungere 20 μl di PBS contenente 1 μg/ml DAPI (4',6-diamidino-2-fenilindolo) e incubare per 30 minuti a temperatura ambiente.
4. Lava le cellule tre volte in PBS e proteggi le macchie dalla luce con carta stagnola.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Brodo di soia triptico (TSB)	Fluka	22092
Kanamicina solfato	Sigma-Aldrich	60615
Bottiglia da 250 ml con tappo a vite	Corning	8396
DMEM	Sigma-Aldrich	D5796
Siero fetale per vitelli (FCS)	Gibco	10270	Inattivazione termica
Targhetta Greiner CELLSTAR a 384 pozzi	Sigma-Aldrich	M2062
Carta di alluminio peelable	Costista	6570
Dispenser di reagenti: "Dispenser di reagenti Multidrop 384"	Thermo Scientific	5840150	Si può utilizzare un dispenser alternativo di reagenti.
Reagente per la trasfezione: "Lipofectamina RNAiMAX	Invitrogen	13778-150
Lavatrice automatica di piatti: "Lavatrice di piastre ELx50-16"	BioTek	ELX5016	Questa lavatrice di piastre contiene un collettore a 16 canali adatto a piastre da 384 pozzi. Si inserisce in un armadietto di biosicurezza e ha un coperchio che copre la piastra durante il lavaggio, riducendo il rischio di produzione di aerosol. Si potrebbero utilizzare rondelle alternative con caratteristiche simili.
Gentamicina	Sigma-Aldrich	G1397
PBS	Gibco	20012
Paraformaldeide	Sigma-Aldrich	P6148	Sciogliere in un tampone HEPES di 0,2 M, pH 7,4. Conserva a -20 °C e scongela il giorno prima dell'uso. Attenzione, il PFA è tossico per inalazione, a contatto con la pelle e se ingerito.
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T9284
DAPI	Roche	10236276001
SiRNA Kif11	Dharmacon	L-003317-00
SIRNA ARPC3	Dharmacon	L-005284-00
Brucella abortus 2308
HeLa CCL-2	ATCC	CCL-2
ImageXpress Micro	Dispositivi molecolari	IXM IMAGING MSCOPUL	Microscopio automatico per immagini cellulari dotato di uno stadio a Z-stage motorizzato di precisione. Possono essere impiegati sistemi alternativi per la microscopia automatica e componenti alternativi per il software rigido e software specificati di seguito.