Fotosbiancamento dei pigmenti cianobatterici per l'imaging delle proteine che regolano la crescita

Abstract

Fonte: Zhan, Y., et al. Il fotosbiancamento consente l'imaging a superrisoluzione dell'anello FtsZ nel cianobatterio Prochlorococcus. J. Vis. Exp. (2018).

Questo video mostra la procedura di fotosbiancamento dei pigmenti nelle cellule cianobatteriche utilizzando luce allo xeno in condizioni di freddo per migliorare l'imaging di fluorescenza delle proteine regolatrici della crescita.

Protocollo

1. Fotosbiancamento dei pigmenti della clorofilla in una fase di blocco

1. Trasferisci il copertino sulla piastra per la tintura. Aggiungi 50 μL di tampone bloccante, che contiene detergente non ionico allo 0,2% (v/v) e siero per capra al 3% (v/v), sopra la copertura.
2. Posizionare l'intera piastra di colorazione sul ghiaccio e spostarla sotto la sorgente luminosa allo xeno per il fotosbiancamento per almeno 60 minuti, con un'intensità luminosa di 1.800 μmol fotoni/^{m 2}·s.
3. Dopo la fotoscolorimento e il blocco, rimuovere con cura il buffer di blocco assorbendolo con il bordo di un tovagliolo di carta.
   NOTA: L'intensità della luce allo xeno è così elevata che sono necessari occhiali da sole adeguati per la protezione degli occhi. Nel frattempo, avvolgi la fonte luminosa e la piastra con della carta di alluminio per evitare perdite di luce, che potrebbero causare danni agli occhi. Controlla la copertura ogni 15 minuti per assicurarti che rimanga umida. Se è asciutto, aggiungi 50 μL di buffer di bloccaggio.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Particelle di polistirene	Spherotech	PP-20-10	2,0-2,4 μm
Copertura	Marienfeld	111580	18 mm ∅, Spessore n. 1
Etanolo	Scharlau	ET00021000
Poli-L-lisina idrobromuro	Sigma-Aldrich	P9155	peso mol 70.000-150.000
Paraformaldeide	Sigma-Aldrich	158127
Soluzione di glutaraldeide, 50%	Sigma-Aldrich	340855
PBS	Sigma	P3813
Triton X-100	Sigma	T8787
Sale disodio EDTA, 2-idrato	Biotecnologia dell'oro	E-210-500
Base Trizma	Sigma	T1503
Lisozima	Sigma	L6876
Siero per capre	Sigma	G9023
Sorgente luminosa XD-300 Xenon			250 W