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1. D2Trattamento di incorporazione O in presenza di antibiotici (Figura 1a)
- Controlla la concentrazione batterica misurando la densità ottica (OD) con un fotometro a una lunghezza d'onda di 600 nm.
- Diluire la soluzione batterica utilizzando il normale mezzo per il brodo Mueller-Hinton (MHB), che non contiene deuterio, per raggiungere una concentrazione cellulare finale di 8 x 105 CFU/mL. Vortice delicatamente per mescolare le cellule batteriche.
- Prepara 300 μL di aliquote della soluzione batterica in sette microtubi da 1,5 mL e 600 μL di aliquote della soluzione batterica in un microtubo da 1,5 mL.
- Aggiungere 4,8 μL di soluzione antibiotica (gentamicina o amoxicillina) (1 mg/mL) nel microtubo contenente 600 μL della soluzione batterica, per portare la concentrazione finale di antibiotico a 8 μg/mL.
- Prelevare 300 μL di soluzione da 8 μg/mL di soluzione batterica contenente antibiotici e aggiungere altri 300 μL di soluzione batterica per ottenere una soluzione batterica antibiotica (4 μg/mL) diluita due volte.
- Ripetere la diluizione seriale doppia degli antibiotici di prova, gentamicina o amoxicillina, fino a raggiungere il microtubo con la concentrazione più bassa (0,25 μg/mL), e scartare 300 μL dal tubetto. Per la gentamicina e l'amoxicillina, le concentrazioni seriali variano da 0,25 μg/mL a 8 μg/mL.
- Lascia un tubo senza antibiotici per il controllo del blank. Questo sarà il controllo positivo per ispezionare l'attività metabolica batterica senza trattamento antibiotico ma con trattamentoD2O.
- Lascia un tubo senza antibiotici e senza vitaminaD2Oper il controllo negativo.
- Incubare l'aliquota batterica con un certo antibiotico (gentamicina o amoxicillina) contenente mezzo MHB per 1 ora.
- Durante l'incubazione, preparare una diluizione seriale di antibiotici con mezzo contenente 100% diD2Oe lo stesso gradiente di concentrazione degli antibiotici preparati nello step 1.6. Per la gentamicina e l'amoxicillina, le concentrazioni seriali variano da 0,25 μg/mL a 8 μg/mL.
- Dopo 1 ora di trattamento antibiotico, aggiungere rispettivamente 700 μL di antibiotico diluito serialmente e mezzo MHB contenente 100% D2O ai 300 μL di batteri pretrattati con antibiotici nella stessa concentrazione di antibiotico (preparati nello step 1.6).
- Ad esempio, aggiungere 700 μL di mezzo MHB contenente al 100% D2O (contenente 8 μg/mL di antibiotico) ai 300 μL dei batteri pretrattati con antibiotici da 8 μg/mL. Allo stesso modo, trasferisci ai tubi corrispondenti della concentrazione successiva e omogeneizza pipettando su e giù più volte.
- Aggiungere 700 μL di mezzo MHB contenente 100% D2O senza antibiotici a 300 μL di batteri senza antibiotici (preparati nel passo 1.6.1) come controllo a vuoto.
- Incubare a 37 °C in uno shaker di incubazione a 200 giri/min per altri 30 minuti.
NOTA: In questa fase, la concentrazione finale di D2O nel mezzo per il test è del 70%.
- Prima centrifuga 1 mL di antibiotico e il campione batterico trattato con D2O a 6200 x g per 5 minuti a 4 °C, poi lava due volte con acqua purificata. Infine, fissare i campioni in soluzione al 10% di formalina e conservarli a 4 °C.
2. imaging stimolato da scattering Raman (SRS) dell'incorporazione metabolica di D2Oin un singolo batterio
- Lavare 1 mL di soluzione batterica fissata con acqua purificata e poi centrifugare a 6200 x g per 5 minuti a 4 °C. Rimuovere il sovrandante. Arricchisci la soluzione batterica a circa 20 μL.
- Deposa la soluzione batterica su un vetro coperto rivestito in poli-L-lisina. Sandwich e sigilla il campione per l'imaging SRS.
- Immagini dei batteri alla frequenza vibrazionale C-D a 2168 cm-1 utilizzando un microscopio SRS.
- Inserisci e regola la lunghezza d'onda della pompa a 852 nm usando il software di controllo di un computer.
- Misura la potenza del laser usando un misuratore di potenza. Imposta la potenza del laser a pompa sul campione a ~8 mW e quella del laser Stokes al campione a ~40 mW regolando la piastra a mezza onda davanti all'uscita laser.
NOTA: Nel microscopio SRS, un laser femtosecondi sintonizzabile con una frequenza di ripetizione di 80 MHz fornisce i laser di eccitazione a pompa (680-1300 nm) e Stokes (1045 nm).
- Regolando le viti degli specchi riflessivi, allineare spazialmente la pompa e i fasci Stokes e dirigere i due fasci verso un microscopio verticale dotato di un sistema di specchi galvo 2D per la scansione laser.
- Usa un obiettivo a immersione 60x per focalizzare la pompa e i laser Stokes sul campione.
- Usa un condensatore d'olio per raccogliere i segnali dal campione in direzione avanti.
- Usa un filtro passa-banda per filtrare il laser Stokes prima di indirizzarlo verso un fotodiodo.
- Estrai il segnale Raman stimolato tramite un amplificatore lock-in e rileva i segnali tramite un fotodiodo.
- Imposta ogni immagine SRS per contenere 200 x 200 pixel e il tempo di permanenza dei pixel per 30 μs nel pannello di controllo del software. Il tempo totale di acquisizione per un'immagine è di ~1,2 s. Imposta la dimensione dello Step a 150 nm, così la dimensione dell'immagine è circa 30 x 30μm 2. Visualizza almeno tre campi visivi per ogni campione.