Imaging confocale ad alta risoluzione degli emociti di Drosophila infettati da patogeni

Abstract

Fonte: Hiroyasu, A., et al. Estrazione di emociti dalle larve di Drosophila melanogaster per infezioni e analisi di microbi. J. Vis. Esp. (2018)

Questo video dimostra immagini confocali ad alta risoluzione degli emociti di Drosophila melanogaster infettati da Coxiella burnetii per visualizzare la localizzazione del patogeno in 3D, consentendo un'analisi dettagliata della dinamica delle infezioni intracellulari e delle interazioni ospite-patogeno.

Protocollo

1. Imaging Confocale
   1. Configurare il microscopio confocale per immagini a tre colori di DAPI (4',6-Diamidino-2-fenilindolo), EGFP (proteina fluorescente verde potenziata) e mCherry. Usa la seguente impostazione: eccitazione DAPI (es) 405 nm, emissione (em) 415-480 nm; EGFP ex 488 nm, em 493-564 nm; mCherry ex 587 nm, em 597-700 nm.
   2. Posizionare il campione sul microscopio e concentrarsi sul campione utilizzando un obiettivo a apertura numerica (NA) di 63X/1.4. Individua gli emociti desiderati nel campo visivo per l'immagini.
   3. Regolare la potenza del laser e i guadagni del rilevatore per ottenere un'esposizione appropriata del campione. Controlla più piani z per assicurarti che il livello di esposizione sia adeguato per l'intero spessore del campione.
   4. Trova le posizioni superiore e inferiore sull'asse z di un intero emocito. Imposta queste posizioni come iniziale e fine per la z-sectioning.
   5. Usa solo lo zoom di scansione per visualizzare l'area che contiene l'emocito. Spesso si usano fattori di zoom di 3X.
   6. Raccogli la serie di immagini a risoluzione appropriata, ad esempio 1024 x 1024 pixel nel piano x-y e a distanza di 0,3 μm nella dimensione z.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Coxiella burnetii - mCherry	Dottor Heinzen, R.
Vetro per rivestimento microscopico	Fisher Scientific	12-545-80
4',6-diamidino-2-fenilindolo	Thermo Fisher Scientific	62247
Microsope confocale	Leica	Microscopio laser a scansione confocale TCS SP8-X
Vedute per microscopio	Fisher Scientific	12-552-3