Analisi a singola cellula dell'espressione genica da patogeni estratti da piante

Abstract

Fonte: Rufián, J. S., et al. Analisi a singola cellula dell'espressione dei geni di Pseudomonas syringae nel tessuto vegetale. J. Vis. Esp. (2022).

Questo video dimostra un metodo per analizzare l'espressione genica in batteri patogeni estratti dalle piante a livello di singola cellula utilizzando un fattore di trascrizione marcato fluorescente. L'imaging confocale rivela eterogeneità nell'espressione genica della virulenza, evidenziando la diversità funzionale all'interno di una popolazione batterica clonale.

Protocollo

1. Analisi a singola cellula dei batteri estratti dall'apoplasto

1. Prepara una soluzione di agarosio all'1,5% in acqua distillata. Una volta fuso, aggiungi abbastanza volume da riempire lo spazio tra due vetrine di microscopia affiancate e posiziona un'altra vetrina sopra (Figura 1). Lasciali asciugare per 15 minuti e rimuovi con cura il vetrino posizionato sopra. Usando una lama, taglia il tampone di agarosio in pezzi da 5 mm x 5 mm poco prima dell'uso.
2. Parallelamente, centrifugare 1 mL dei batteri estratti dall'apoplasto a 12.000 x g per 1 minuto a temperatura ambiente, rimuovere con cura il sovrantantante con una pipetta e risospendere il pellet in 20 μL d'acqua per concentrare le cellule. Posizionare una goccia di 2 μL delle celle concentrate su un copricapo da 0,17 mm e coprire la goccia con un pezzo da 5 mm x 5 mm del tampone di agarosio precedentemente ottenuto nel passo 1, come rappresentato nella Figura 1.
3. Visualizza la preparazione batterica al microscopio confocale (vedi Tabella dei Materiali). Per identificare i batteri fluorescenti verdi, si utilizza il laser di eccitazione a 488 nm e un filtro a emissione che va da 500 nm a 550 nm. Per identificare tutti i batteri, usa il campo chiaro e uni entrambi i campi.
4. Elaborare le immagini confocali usando Fiji (vedi Tabella dei Materiali). Per farlo, usa il plugin MicrobeJ per identificare il contorno della cellula batterica e misurare l'intensità di fluorescenza al suo interno.
   NOTA: Per questa analisi è consigliata l'acquisizione di immagini da batteri isolati (non raggruppati).

Risultati

Figura 1: Rappresentazione schematica della montatura e preparazione del tampone agar.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Copertura da 0,17 mm			Nessun requisito speciale
Rete metallica 1,6 x 1,6 mm	Buzifu		Rete schermata in fibra di vetro
Tubi conici da 50 mL	Sarstedt
Agarose	Merk
Microscopio Confocale Stellaris	Leica Microsystems
Software delle Figi