1. Ceppi e condizioni di coltura
NOTA: La comunità orale sintetica era composta da ceppi comunemente presenti nel microbioma orale.
- Ottieni i seguenti ceppi dalla American Type Culture Collection (ATCC): Aggregatibacter actinomycetemcomitans (ATCC 43718), Fusobacterium nucleatum (ATCC 10953), Porphyromonas gingivalis (ATCC 33277), Prevotella intermedia (ATCC 25611), Streptococcus mutans (ATCC 25175), Streptococcus sobrinus (ATCC 33478), Actinomyces naeslundii (ATCC 51655), Streptococcus gordonii (ATCC 49818), Actinomyces viscosus (ATCC 15987) e Streptococcus mitis (ATCC 49456).
- Acquisire Veillonella parvula dalla Leibniz Institute DSMZ-German Collection of Microorganisms and Cell Cultures (DSM 2007), Streptococcus sanguinis dalla BCCM/LMG Bacteria Collection (LMG 14657), e utilizzare il ceppo di Streptococcus salivarius TOVE-R e Streptococcus oralis.
2. Sviluppo di una comunità multispecie rappresentativa del microbioma orale
NOTA: Generare una comunità sintetica per simulare la potenziale capacità di adesione dei batteri orali all'epitelio intestinale in vitro . Far crescere batteri su piastre di agar nel sangue integrate con 5 μg/mL di emin, 1 μg/mL di menadione e 5% di sangue sterile defibrinato di cavallo. In breve:
- Scioglie 100 mg di emina in 2 mL di 1 idrossido di sodio (NaOH) e aggiunga 100 mL di acqua distillata autoclavata. Conserva in un contenitore buio. Sterilizza attraverso un filtro da 0,22 μm prima di aggiungere al mezzo.
- Sciogliere 100 mg di menadione in 20 mL di etanolo al 96%. Sterilizza attraverso un filtro da 0,22 μm prima di aggiungere al mezzo.
- Prepara 1 L di mezzo di agar sanguigno (vedi Tabella dei materiali) secondo le istruzioni del produttore e l'autoclave. Lascia raffreddare prima di aggiungere il sangue del cavallo e gli integratori. Mescola e versa i piatti.
- Prepara un brodo modificato per infusione cerebrale e cuore (BHI). Aggiungi 5 μg/mL di emina e 1 μg/mL di menadione dopo l'autoclavi.
- Erogare 9 mL del mezzo in tubi Hungate e chiudere con un tappo in gomma e un tappo in alluminio. Risciacquo i tubi con azoto/anidride carbonica o N2/CO2 (90%/10%).
- Prendere 1 mL di mezzo anaerobico con una siringa e metterlo in un tubo microcentrifuga da 1,5 mL. Scegli singole colonie di ciascuna specie batterica, risospendi nel mezzo e trasferisci nuovamente nel BHI modificato anaerobico. Incubare per 48 ore a 37 °C, tranne S. salivarius, che deve essere incubato per 24 ore.
- Se necessario, conferma la purezza delle culture prima di riunire la comunità sintetica. In breve:
- Estrarre il DNA dalle colture liquide e amplificare il gene 16S rRNA usando i primer 27F (AGAGTTTGATYMTGGCTCAG) e 1492R (TACGGYTACCTTGTTACGACT), e il seguente programma: 5 minuti a 95 °C, 30 cicli a 95 °C per 1 minuto, 55 °C per 1 minuto e 72 °C per 1,5 minuti, seguiti da un passo finale di estensione di 5 minuti a 72 °C.
- Purificare il prodotto della reazione a catena della polimerasi (PCR) con un kit commerciale (vedi Tabella dei Materiali), seguendo le istruzioni del produttore.
- Eseguire la reazione di sequenziamento dei prodotti purificati in un volume totale di 10 μL contenente 0,5 μL di colorante (vedi Tabella dei Materiali), 3,2 pmol di primer M13f (CGCCAGGGTTTTCCCAGTCAGTCACGAC), 2,0 μL di tampone di sequenziamento 5x e 20 ng di modello, utilizzando un sistema di sequenziamento commerciale con kit (vedi Tabella dei Materiali).
NOTA: Abbiamo fatto eseguire questa procedura commercialmente. - Esegui una ricerca BLAST su tutte le sequenze (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) per determinare il taxon conosciuto più vicino e confronta con la sequenza del ceppo originale utilizzando lo strumento online RDP Classifier (http://rdp.cme.msu.edu/) e il servizio SINA Alignment (https://www.arb-silva.de/aligner/).
- Misura il numero cellulare alla fine dell'incubazione, utilizzando citometria a flusso e colorazione SYBR Green/Propidium Ioduro. Diluire le colture a 105 cellule mL-1, usando BHI modificato.
- Aggiungi 1 mL di S. mitis a 75 mL di BHI anaerobico e incuba fino alla fase stazionaria (6 ore). Successivamente, raccogli 0,75 mL di ogni ceppo diluito e mescola in condizioni anaerobiche.
- Una volta che tutte le colture sono state mescolate, prendi 1 mL del microcosmo e aggiungi ai 75 mL di BHI. Incubare la comunità sintetica sotto il 10% diCO2, 10% di idrogeno (H2), 80% di N, per 48 ore a 37 °C e 200 giri/min (vedi Tabella dei Materiali).
- Misura la densità cellulare come in 2.8. prima di presentare la comunità al modello cellulare. La composizione della comunità può essere valutata con una PCR quantitativa in tempo reale. Inoltre, utilizzare il sequenziamento del genio amplicon 16S rRNA per fornire informazioni sui membri iniziali presenti. Per entrambi i protocolli di conferma dell'identità, usa il cDNA come modello per indicare che i batteri stanno attivamente trascrivendo proteine, e usa il DNA come modello per rivelare la presenza o l'assenza dei ceppi.
3. Pratiche generali di coltura cellulare
NOTA: Ottenete linee cellulari utilizzate dalla Collezione Europea di Colture Cellulari Autenticate (Caco-2 ECACC 86010202 e HT29-MTX-E12 ECACC 12040401, Public Health England, Regno Unito). I reagenti per la coltura cellulare possono essere acquistati (vedi Tabella dei Materiali), salvo diversa specificazione.
- Mantenimento e passaggio delle linee cellulari Caco-2 e HT29-MTXNota: Le cellule Caco-2 e HT29-MTX vengono coltivate regolarmente in fiaschette di colturatessutale da 25 cm 2 contenenti il mezzo Eagle modificato di Dulbecco (DMEM) integrato (Tabella 1). Le cellule vengono tripsinizzate quando si raggiunge il 60–70% di confluenza.
- Rimuovi il mezzo di coltura cellulare dalle fiasche. Lava due volte con 5 mL di PBS senza calcio/magnesio (Ca++/Mg++).
- Aggiungi 2 mL di una soluzione da 0,5 mg/L di tripsina e 0,22 g/L di acido etilenicodiamine tetraacetico (EDTA). Distribuisci la soluzione di tripsina muovendo delicatamente la fiaschetta. Rimuovere 1,5 mL della soluzione di tripsina e incubare la fiaschetta a 37 °C per 10 minuti.
- Controlla al microscopio se le cellule sono staccate dalla superficie della fiaschetta. Incuba per altri 5 minuti, se necessario.
- Aggiungere 5 mL di materiale di coltura cellulare integrato alla fiaschetta per inattivare la tripsina. Pipetta su e giù per ottenere una sospensione omogenea a singola cellula.
- Immediatamente, si prende un'aliquota da 50 μL della sospensione cellulare e mescola con una soluzione sterile di blu di Trypan allo 0,4% in proporzione 1:1 (v/v) per le cellule Caco-2 o 1:5 v/v per HT29-MTX. Mescola tramite pipetto e carica in una camera di conteggio (vedi Tabella dei Materiali).
- Contare le cellule vitali (cellule bianche luminose) al microscopio (vedi le istruzioni del produttore).
- Seme in una nuova fiaschetta a una densità di 4 x 105 celle/cm 2 e 1 x 104 celle/cm2, rispettivamente per Caco-2 e HT29-MTX.
NOTA: (1) Le cellule Caco-2 si differenziano e formano giunzioni strette una volta raggiunta la confluenza. È estremamente importante evitare la sovraconfluenza prima della tripsinizzazione. La crescita eccessiva di cellule nel fiaschone può causare il fallimento del distacco cellulare dopo tripsinizzazione e/o aggregazione cellulare. (2) Le cellule HT29-MTX sono cellule produttrici di muco con alta attività metabolica. Queste caratteristiche possono causare una rapida acidificazione del materiale di coltura cellulare, specialmente se le cellule sono ad alta densità. Il tampone 4-(2-idrossietil)-1-piperazina-etanosulfonico (HEPES) può essere aggiunto al mezzo di coltura cellulare (Tabella 1) per mantenere il pH tra 7 e 7,2. Se il pH scende, il mezzo può essere sostituito quando la confluenza è inferiore al 50%. Tuttavia, se la confluenza >50%, la coltura cellulare deve essere suddivisa.
4. Assemblaggio di un modello di cellula multicompartimento che simula l'interfaccia intestino-host-microbo
NOTA: Completare la co-coltura in pozzi a doppia camera (diametro 24 mm, dimensione poro 0,4 μm; vedi Tabella dei Materiali).
- Aggiungere 1,5 mL di mezzo completo di coltura cellulare al compartimento apicale e 2 mL al basale. Pre-incubare per 20–30 minuti per ottenere una distribuzione uniforme della sospensione cellulare durante la semina.
- Tripsinizzare la coltura cellulare di Caco-2 e HT29-MTX come descritto nella sezione 3. La procedura di tripsinizzazione deve essere seguita accuratamente per ottenere una distribuzione omogenea di entrambe le linee cellulari, in una singola sospensione cellulare, senza grumi.
- Contare le cellule vitali come descritto nella 3.1.8.
- Regolare la densità cellulare a 6,5 x 104 cellule/cm2 in una proporzione 90/10 di celle Caco-2/HT29-MTX.
- Omogeneizzare le sospensioni cellulari e aggiungere il volume corrispondente di cellule Caco-2 e HT29-MTX a un contenitore sterile pre-riempito con materiale di coltura cellulare integrato. Rimuovere il materiale pre-incubato dal lato apicale della camera tramite aspirazione.
- Mescola delicatamente la sospensione cellulare tramite pipetto e trasferisci 1,5 mL nel compartimento apicale degli inserti della camera. La procedura di semina richiede un'omogeneizzazione costante della sospensione cellulare, poiché le cellule tendono a sedimentare. A seconda dell'esperienza dell'utente e della velocità di lavoro, la sospensione delle celle deve essere miscelata dopo aver erogato 1–3 pozzi.
- Muovi delicatamente le piastre avanti e indietro e poi da destra a sinistra a destra (5–10 volte) per ottenere una distribuzione uniforme delle cellule nel pozzo. Trasferisci nell'incubatrice e ripeti il movimento delle piastre.
- Mantenere la co-coltura delle cellule Caco-2/HT29-MTX per 15 giorni, rinfrescando i compartimenti apicale e basale ogni 2 giorni con DMEM integrato. Dopo questo periodo, il materiale di coltura cellulare può essere sostituito da DMEM integrato senza soluzione antibiotica/antimicotica.
- Mantieni il sistema fino a 20–21 giorni dopo la semina rinfrescando il substrato ogni 2 giorni.
- Misurare l'integrità della barriera epiteliale prima di iniziare il saggio, utilizzando un Sistema di Resistenza Elettrica (vedi Tabella dei Materiali), seguendo le istruzioni del produttore.
- Assicurati che l'apparecchiatura di resistenza elettrica transepiteliale (TEER) sia completamente carica (>24 h) prima di iniziare le misurazioni.
- Scollega l'apparecchiatura TEER dall'alimentatore e copri con un sacchetto di plastica per autoclave. Fai un foro nel sacchetto per introdurre l'elettrodo e collegarlo alla porta di ingresso del misuratore. Spruzza con etanolo/acqua (v/v) al 70% prima di introdurre l'attrezzatura TEER nell'armadio di scorrimento.
- Per disinfettare l'elettrodo, immergi le punte dell'elettrodo in una soluzione al 70% etanolo/acqua (v/v) per 15 minuti. Lascia asciugare all'aria per 15 secondi. Risciacquare l'elettrodo in un mezzo di coltura cellulare preriscaldato.
- Estrai le celle dall'incubatore e lascia che le cellule raggiungano la temperatura ambiente all'interno dell'armadietto del flusso.
- Assicurati che il contatore sia scollegato dal caricabatterie. Imposta l'interruttore di modalità su Ohms e accendi l'interruttore di accensione.
- Misura la resistenza della cella immergendo l'elettrodo con la punta più corta nell'inserto e la punta più lunga fuori dal pozzo. Mantieni l'elettrodo a un angolo di 90° rispetto all'inserto della piastra.
5. Sopravvivenza batterica dopo condizioni di transito gastrointestinale in vitro
NOTA: Prepara tutte le diluizioni con acqua ultrapura. Sterilizza tutte le soluzioni tramite un filtro da 0,22 μm ed esegui la procedura di digestione in condizioni sterili.
- Digestione orale:
- Mettere 3 mL della comunità batterica in un tubo sterile da 50 mL, mescolare con 3 mL di liquido salivare simulato (SSF), contenente (in mmol L-1): cloruro di potassio (KCl), 15,1; fosfato di diidrogeno di potassio (KH2PO4), 3,7; bicarbonato di sodio (NaHCO 3), 6,8; cloruro di magnesio esaidrato [MgCl2(H2O)6], 0,5, carbonato di ammonio [(NH4) CO3], 0,06; acido cloridrico (HCl), 1.1; cloruro di calcio diidrato [CaCl2(H2O)2], 0,75. Aggiungi 75 U/mL di α-amilasi dalla saliva umana di tipo IX-A e 2 g/L di mucina dallo stomaco suino di tipo II alla SSF.
- Incuba il composto per 2 minuti a 37 °C e 100 giri/min. Raccogliere un campione di 2 mL per l'estrazione del DNA e la quantificazione della citometria di flusso (S1).
- Digestione gastrica:
- Aggiungere 4 mL di liquido gastrico simulato (SGF), contenente (in mmol L-1): KCl, 6,9; KH2PO4, 0,9; NaHCO3, 25; cloruro di sodio (NaCl), 47,2; MgCl2(H2O)6, 0,1; (NH4)CO3, 0,5; HCl, 15,6; CaCl2(H2O)2, 0,075. Inoltre, l'SGF conteneva 2 g/L di mucina proveniente dallo stomaco suino di tipo II.
- Misura il pH e aggiusta a pH 3 con 1 M HCl, se necessario. Incubare a 37 °C e 100 giri/min. Raccogli un campione da 2 mL (S2).
- Digestione dell'intestino tenue:
- Aggiungere 4 mL di liquido intestinale simulato (SIF) contenente (in mmol L-1): KCl, 6,8; KH2PO4, 0,8; NaHCO3, 85; NaCl, 38,4; MgCl2(H2O)6, 0,33; HCl, 8.4; CaCl2(H2O)2, 0,3, al tubo di digestione.
- Regola a pH 7 con 1 M di NaOH, se necessario. Incubare a 37 °C e 100 giri/min. Raccogli un campione da 2 mL (S3).
6. Capacità di colonizzazione batterica dopo condizioni di transito gastrointestinale in vitro
- Centrifuga 2 mL della digestione dell'intestino tenue per 10 minuti a 2.650 x g.
- Rimuovi il soprandanante e mescola il pellet batterico con 5 mL di DMEM integrato senza antibiotici né antimicotici.
- Tingere e quantificare le cellule intate/danneggiate utilizzando un citometro a flusso (vedi Tabella dei Materiali).
- Regolare la densità cellulare a 105 cellule vitali/mL diluendo DMEM integrato senza antibiotici e antimicotici.
- Rimuovere il mezzo apicale del sistema transwell e aggiungere 1,5 mL di sospensione batterica. Co-coltura del sistema per 2 ore in condizioni generali di coltura cellulare (37 °C, 95% di umidità, 5% di CO2).
NOTA: Questo tempo può essere esteso fino a 48 ore, a seconda del protocollo sperimentale richiesto. La co-coltura può essere mantenuta in un incubatore diverso da quello utilizzato per la manutenzione cellulare di routine, per evitare contaminazioni. - Misurare i valori TEER dopo l'incubazione per valutare l'integrità della barriera epiteliale come descritto in 4.11.
- Al termine del tempo di incubazione, rimuovere il substrato apicale e raccogliere 0,5 mL per ulteriori analisi (S4). Un sottocampione di substrato può essere utilizzato per la valutazione della vitalità cellulare tramite il saggio sul lattato deidrogenasi (LDH) (vedi Tabella dei materiali), seguendo le istruzioni del produttore.
- Aggiungere 0,5 mL di 10 mM N-acetilcisteina in HBSS (tampone NAC) per solubilizzare il muco prodotto dall'HT29-MTX e recuperare i batteri aderenti. Incubare le placche a 37 °C per 1 ora, sotto agitazione (135 giri al minuto, vedi Tabella dei materiali).
- Recuperare il NAC-HBSS in un tubo microcentrifuga (S5) e lavare le cellule due volte con 1 mL di DPBS.
- Aggiungi 0,5 mL di 0.5% di Triton X-100 (w/v) sopra i monostrati, interrompi le cellule pipettando, recupera il liquido e fai il vortice per 1 minuto. La rapidità è fondamentale per evitare di danneggiare le cellule batteriche con il detersivo.
- Centrifugare le celle per 5 minuti a 2.650 x g, e separare il soprandanante (S6) e il pellet (S7).
7. Analisi del campione
NOTA: Analizzare i campioni raccolti (S1-S7) per valutare la vitalità batterica e il potenziale di adesione alle cellule intestinali, dopo una digestione gastrointestinale simulata.
- Vitalità batterica: Passare due volte i campioni S1-S5 attraverso un filtro da 0,45 μm e quantificare le cellule batteriche utilizzando colorazione di cellule vive/morte e citometria a flusso, come indicato nel passo 2.8.
- Potenziale di adesione: Preparare diluizioni seriali (-1-8) per S1-S6 e strisciare 10 μL in agar ematico e placche BHI modificate. Incubare a 37 °C in condizioni anaerobiche per 24–48 ore. Impiega lo stesso volume di S7 non diluito.
- Identificazione tassonomica dei batteri aderiti:
- Scegli le singole colonie con un anello di coltura e risospendi ciascuna in 10 μL di acqua priva di nucleasi. Raccogli 4 μL di questa sospensione e utilizzali come modello per l'amplificazione PCR del gene 16S rRNA utilizzando i primer e le condizioni descritte in 2.7.1.
- Eseguire sequenziamento seguendo il protocollo in 2.7.3 e validare la sequenza utilizzando la procedura inclusa in 2.7.4.
- Effettuare ulteriori analisi a valle come estrazione totale del DNA, quantificazione qPCR e/o sequenziamento degli amplicon 16S rRNA, estrazione di RNA e profilazione trascrivomica secondo desiderio.
NOTA: La quantificazione della citometria a flusso è stata eseguita immediatamente dopo il campionamento. Come controllo per le cellule permeabilizzate alla membrana, è stato utilizzato un campione esposto a 70 °C per 3 minuti. Il rumore di fondo è stato valutato misurando con citometria a flusso i fluidi digerenti o i campioni ottenuti dal modello di coltura cellulare senza batteri. Ogni campione è stato misurato in triplice.
Tabella 1: Descrizione delle linee cellulari e della composizione del materiale per la manutenzione delle colture cellulari.
| Coltura cellulare | Aderente/Sospensione | Mezzo di coltivazione | Supplementi generali | Integratori specifici | Raddoppio del tempo | Condizioni di incubazione |
| Caco-2 (ECACC 86010202) | Aderente | Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) con 4,5 g/L di glucosio | Siero fetale bovino inattivato (10% v/v) Penicillina (100 U/mL)* Streptomicina (0,1 mg/mL)* Anfotericina (0,0025 mg/mL)* | Glutamasiate (4 mM) Amminoacidi non essenziali (1% v/v) Piruvato (1 mM) | 65–72 h | Incubatore 95% di umidità e 10% CO2 CO2 (vedi Tabella dei Materiali) |
| HT29-MTX (ECACC 12040401) | Aderente | HEPES (1 mM) | 20–24 ore |
| * Antibiotici e antifungini sono stati rimossi dal mezzo di coltura cellulare 2 giorni prima dell'inizio dei saggi. |