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1. Isolare il DNA genomico dal tessuto vegetale utilizzando un kit di estrazione genomica
- Ottieni tessuto fogliare di agrumi tagliando una foglia nuova intera da un albero di agrumi usando forbici pulite, e metti la foglia in un sacchetto di plastica pulito per panini.
NOTA: La busta contenente il tessuto fogliare deve essere posta in un frigorifero a 4 °C o su ghiaccio in un contenitore isolato il prima possibile dopo la raccolta per evitare il deterioramento. - Aggiungi una piccola quantità di azoto liquido per raffreddare un mortaio e un pestello. Mentre si raffreddano, usa delle forbici per tagliare un piccolo pezzo di tessuto fogliare, di circa 1 pollice quadrato. Metti il tessuto tagliato nella malta per congelarlo istantaneamente. Aggiungi più azoto liquido, se necessario.
NOTA: I guanti isolati devono sempre essere indossati durante la maneggiatura di azoto liquido. - Macina rapidamente il tessuto vegetale fino a farlo in polvere fine usando la morta. Continua a macinare finché l'azoto liquido non evapora completamente e rimane una polvere verde fine.
- Raffreddare brevemente una spatola metallica in azoto liquido per 10-15 secondi, poi scavare il tessuto macinato all'interno della malta in un tubo microcentrifuga da 1,5 mL, usando la spatola.
- Aggiungere 600 μL di soluzione di lisi nucleica (vedi Tabella dei materiali) utilizzando una pipetta da 1000 μL. Vortice il campione per 1 - 3 secondi, poi incubare in un bagno d'acqua a 65 °C per 15 minuti.
- Aggiungi 3 μL di soluzione RNase al lisato usando una pipetta da 10μL, inverti il tubo 2-5 volte per mescolarlo e incuba a 37 °C in un incubatore da armadio per 15 minuti.
NOTA: Lascia raffreddare la miscela alla temperatura ambiente prima di procedere. - Aggiungi 200 μL di Soluzione per la Precipitazione Proteica, fai il vortice ad alta velocità per 20 secondi, poi centrifuga per 3 minuti a 13.000 x g per formare una pellet compatta. Durante la centrifugazione, aggiungere 600 μL di isopropanolo a temperatura ambiente in un tubo microcentrifugo fresco da 1,5 mL.
- Utilizzando una pipetta da 1000 μL, rimuovere con cura il soprantantante dal campione centrifugato, trasferindolo nel tubo microcentrifugo fresco da 1,5 mL contenente isopropanolo. La pallina può ora essere scartata.
NOTA: Evita di contaminare il soprannatante con proteine lasciando una minima quantità di soprandante sopra la pellet. - Inverti il tubo finché il DNA non diventa visibile come una massa di filamenti filofili, poi centrifuga a 13.000 x g per 1 minuto a temperatura ambiente.
- Esprimi il soprantantante, aggiungi 600 μL di etanolo al 70% al pellet, inverti il tubo più volte per lavare il DNA e centrifuga a 13.000 x g per 1 minuto.
- Aspirare con cura l'etanolo, lasciando il pellet di DNA sciolto, poi aprire e invertire il tubo, appoggiandolo su carta assorbente. Asciuga all'aria a temperatura ambiente per 15 minuti.
- Aggiungere 100 μL di Soluzione di Reidratazione del DNA al pellet di DNA essiccato, poi incubare il DNA in un bagno d'acqua a 65 °C per 1 ora, mescolando periodicamente con il tubo con un colpo di sollievo.
- Inserire 1 μL di acqua purificata in una microcuvette e inserirla in uno spettrofotometro da usare come blank. Calcola la concentrazione di DNA presente posizionando 1 μL del campione nella microcuvette e inserendolo nello spettrofotometro. La concentrazione di DNA (ng/μL) può essere calcolata come (A260 -A 320) × fattore di diluizione × 50 ng/μL.
NOTA: Il protocollo può essere messo in pausa qui. Il campione può essere conservato a 4 °C.