Questo video illustra la produzione di pseudovirus influenzali in cellule umane mediante trasfezione di plasmidi mediata da fosfato di calcio, consentendo la generazione sicura di particelle virali a ciclo singolo per applicazioni successive, come saggi di neutralizzazione degli anticorpi, in condizioni di livello di sicurezza biologica 2.
Articolo metodologico
Produzione di pseudovirus tramite trasfezione di plasmidi in cellule umane
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31 agosto 2026
In questo articolo
Abstract
Protocollo
1. Incapsulamento del pseudovirus mediante trasfezione con fosfato di calcio
- Preparare sospensioni cellulari singole di cellule HEK293FT (9 x 105 per mL) in mezzo DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) completo (Tabella 1). Aggiungere 10 mL della sospensione cellulare singola in un’aliquota T75 e incubare le cellule in un incubatore a 37 °C, 5% di anidride carbonica (CO2) per 20 h prima della trasfezione.
NOTA: Si consiglia l’uso di HEK293FT a basso passaggio (<20 passaggi). Assicurarsi che il monostrato cellulare sia confluenza 80-90%. - Sostituire il mezzo con 10 mL di mezzo completo fresco contenente clorochina (100 µM) 2 h prima della trasfezione.
- Mescolare i reagenti e il DNA plasmidico come indicato in Tabella 2 e Figura 1: ddH2O (acqua doppia distillata), pCMV/R-HA, pCMV/R-NA, pHR-Luc, pCMV Δ8.9, CaCl2 2,5 M (cloruro di calcio) e tampone HEPES 2x 4-(2-idrossietil)-1-piperazinaetansolfonico (HEPES). Pipettare delicatamente su e giù per 5 volte; incubare la miscela a temperatura ambiente (RT) per 20 min.
- Trasferire la miscela nel mezzo sopra le cellule e agitare delicatamente il flacone. Incubare le cellule nell’incubatore per 15 h.
- Sostituire il mezzo con 15 mL di mezzo DMEM completo fresco. Incubare le cellule in un incubatore a 37 °C, 5% CO2 per 65 h.
NOTA: Il colore del mezzo sarà arancione chiaro o leggermente giallognolo, e almeno l’80% delle cellule dovrebbe mostrare l’effetto citopatico (CPE) al microscopio invertito. - Raccogliere il soprannatante e centrifugarlo a 2095 x g per 20 min a 4 °C. Raccogliere il soprannatante, aliquotarlo e conservarlo a -80 °C.
Tabella 1: Composizione del mezzo DMEM completo.
| Composizione del mezzo DMEM completo | Concentrazione |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | 1x |
| Siero bovino fetale | 10% |
| Penicillina (1 U/mL)/Streptomicina | 1 μg/ mL |
Tabella 2: Sistema di confezionamento del pseudovirus.
| Materiali | Concentrazione | Volume |
| 2x HEPES (pH 7.1) | -- | 675.0 μL |
| CaCl2 (2.5 M) | -- | 67.5 μL |
| ddH2O | -- | 529.2 μL |
| pCMV Δ 8.9 | 1000 ng/μL | 18.9 μL |
| pCMV/R-HA | 100 ng/μL | 27.0 μL |
| pCMV/R-NA | 50 ng/μL | 13.5 μL |
| pHR-Luc | 1000 ng/μL | 18.9 μL |
Risultati
Figura 1: Diagramma di flusso della trasfezione mediata da calcio. Questo diagramma di flusso viene utilizzato per descrivere le principali procedure della trasfezione mediata da calcio.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Cloruro di calcio anidro | AMRESCO | 1B1110-500G | Reagente |
| Cloroquina difosfato | Selleck | S4157 | Reagente |
| Mezzo Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | 12100-046 | Reagente |
| Serum fetale bovino | Gibco | 16000-044 | Reagente |
| Linea cellulare HEK293FT | Gibco | R700-07 | Linea cellulare |
| Acido HEPES libero | AMRESCO | 0511-250G | Reagente |
| Kit ELISA per antigene p24 dell'HIV-1 | ZeptoMetrix | 801111 | Kit di reagenti |
| Confezione refrigerante per sistema saggio luciferasi | Promega | E4530 | Kit di reagenti |
| Provette microcentrifuga 1,5 mL | Thermo fisher scientific | 509-GRD-Q | Materiale monouso |
| Provette coniche per centrifuga Nunc da 15 mL | Thermo fisher scientific | 339650 | Materiale monouso |
| Penicillina-streptomicina | Gibco | 15140-122 | Reagente |
| Punte per pipetta (10 μL) | Thermo fisher scientific | TF102-10-Q | Materiale monouso |
| Punte per pipetta (100 μL) | Thermo fisher scientific | TF113-100-Q | Materiale monouso |
| Punte per pipetta (1000 μL) | Thermo fisher scientific | TF112-1000-Q | Materiale monouso |
| Pipette serologiche (5 mL) | Thermo fisher scientific | 170355N | Materiale monouso |
| Pipette serologiche (10 mL) | Thermo fisher scientific | 170356N | Materiale monouso |
